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在拟南芥中发现有20个谷氨酸受体基因的家族(Arabidopsis thaliana glutamatereceptor gene family),该家族编码的氨基酸序列和动物离子通道型谷氨酸受体(iGluRs)有很高同源性,并可分为3个亚族,其中的Ⅱ型亚族由9个基因组成。为了研究这9个基因的表达模式,本研究采用构建AtGLR基因启动子融合GUS基因转化野生型拟南芥的方法,从空间和时间角度研究这些基因在植物不同组织中的表达。同时以该亚族9个基因为目标基因设计了两个amiRNA干涉载体,用于基因沉默。主要结果如下:
1.GUS载体构建和转基因:应用分子克隆技术构建AtGLR基因Promoter∷GUS双元载体,重组到拟南芥基因组中。筛选得到转基因T2代后,分别对萌发10天和6周左右的植株进行GUS染色。本实验一共获得6个株系的转基因拟南芥,其中AtGLR2.3、AtGLR2.5、AtGLR2.6、AtGLR2.8和AtGLR2.9对应的株系的染色结果显示:AtGLR2.3、AtGLR2.6、AtGLR2.9和AtGLR2.5在植株发育的幼苗阶段表达,前三者在幼苗叶片的不同部位各有表达,而AtGLR2.5的表达则集中在幼苗根部;AtGLR2.8在幼苗的叶、根尖以及成熟植株的叶片、表皮毛、花药和角果中均有表达,且表达量高。这些差异说明上述基因的表达具有时空调控的特异性
2.amiRNA干涉载体构建和基因沉默:设计amiRNA干涉载体,通过转基因获得拟南芥AtGLR基因缺陷型突变体。本研究分别针对AtGLR2.1-2.4和AtGLR2.5-2.9设计了两个amiRNA干涉载体,沉默了AtGLR2.4、AtGLR2.8、AtGLR2.9这三个基因,降低了AtGLR2.3的表达。这几个株系的AtGLR基因敲除突变体可以用于后续的生理生化实验。
1.GUS载体构建和转基因:应用分子克隆技术构建AtGLR基因Promoter∷GUS双元载体,重组到拟南芥基因组中。筛选得到转基因T2代后,分别对萌发10天和6周左右的植株进行GUS染色。本实验一共获得6个株系的转基因拟南芥,其中AtGLR2.3、AtGLR2.5、AtGLR2.6、AtGLR2.8和AtGLR2.9对应的株系的染色结果显示:AtGLR2.3、AtGLR2.6、AtGLR2.9和AtGLR2.5在植株发育的幼苗阶段表达,前三者在幼苗叶片的不同部位各有表达,而AtGLR2.5的表达则集中在幼苗根部;AtGLR2.8在幼苗的叶、根尖以及成熟植株的叶片、表皮毛、花药和角果中均有表达,且表达量高。这些差异说明上述基因的表达具有时空调控的特异性
2.amiRNA干涉载体构建和基因沉默:设计amiRNA干涉载体,通过转基因获得拟南芥AtGLR基因缺陷型突变体。本研究分别针对AtGLR2.1-2.4和AtGLR2.5-2.9设计了两个amiRNA干涉载体,沉默了AtGLR2.4、AtGLR2.8、AtGLR2.9这三个基因,降低了AtGLR2.3的表达。这几个株系的AtGLR基因敲除突变体可以用于后续的生理生化实验。