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类胡萝卜素是一类由植物和某些光合微生物产生的亲脂性异戊二烯类染料,广泛存在于自然界中。根据类胡萝卜素种类和裂解位置的不同,可生成多种在生物体内有重要功能的衍生物,如维生素、植物激素及芳香类化合物等;其裂解衍生的降异戊二烯化合物由于具有较低的香气阈值而成为评价酒品质的重要指标。类胡萝卜素裂解酶是一类对类胡萝卜素具有催化作用,可将底物转为目标产物的生物酶类,不仅存在于植物和动物中,也存在于部分微生物中,如真菌、变形细菌和光合细菌等。然而,目前有关葡萄球菌及其所产类胡萝卜素裂解酶的研究甚少。本课题组前期研究表明,巴氏葡萄球菌TS-82可高效降解类胡萝卜素,并初步判定其发酵液中含有相关的类胡萝卜素裂解酶。为阐述巴氏葡萄球菌TS-82所产类胡萝卜素裂解酶的酶学特性及其催化底物的作用机理,以微生物菌株TS-82为材料,研究其致病性并优化培养条件;分离纯化类胡萝卜素裂解酶;从该酶的酶学特性、底物特异性、催化不同底物生成的香气物质和非香气物质等方面进行研究,获得以下结果:(1)巴氏葡萄球菌的致病性及其产类胡萝卜素裂解酶的特性。测定菌株TS-82的毒力因子,并对该菌株进行药敏试验,结果表明该菌株不产生与毒素相关的酶,不具备致病性,只对四环素具有耐药性,可安全用于食品加工。采用响应面分析对S.pasteuri TS-82的培养条件进行优化,得到最适培养基为:蔗糖41g/L,K2HPO4 1g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,KCl 0.5g/L,NaNO3 3g/L,酵母浸粉3.7g/L,调pH至7.0;培养条件为温度36℃,接种量2%,培养时间16h,此条件下可提高TS-82菌株所产类胡萝卜素裂解酶的酶活。(2)酶的分离纯化。采用Mono Q 10/100 GL强阴离子柱、高效制备液相和Superdex Peptide 10/300 GL多肽分子筛技术,对S.pasteuri TS-82中的类胡萝卜素裂解酶进行分离纯化,所得纯酶降解β-胡萝卜素的比活力为125U/g,纯化倍数为446,回收率为2.39%。经高效液相色谱(HPLC)分析,确定该酶为单一峰,纯度达到95%以上。纯化后的类胡萝卜素裂解酶经LC-ESI/MS测定,得其分子量为655.093Da。(3)酶学特性研究。关于底物特异性,利用柱层析纯化后的酶,分别作用于β-阿朴-8’-胡萝卜醛、β-胡萝卜素、玉米黄质、角黄质、虾青素和番茄红素六种底物,结果发现所得纯酶可催化降解前五种底物,未检测到其体外作用于番茄红素的活性。采用Lineweaver-Burk法作图,求取米氏常数和最大反应速率。按上述底物顺序,测得的Km值分别为15.403、10.99、9.846、11.285和10.952μM,最大反应速率Vmax分别为0.922、0.962、1.406、1.089和1.044μM/min,说明该酶与五种底物亲和力排列为:玉米黄质>虾青素>β-胡萝卜素>角黄质>β-阿朴-8’-胡萝卜醛,底物转化率为:玉米黄质>角黄质>虾青素>β-胡萝卜素>β-阿朴-8’-胡萝卜醛。关于酶学特性,研究发现该酶对C40类类胡萝卜素底物的最适温度为60℃,而作用于β-阿朴-8’-胡萝卜醛的最适温度是50℃,该酶的稳定温度为50℃以下;该酶对文中考察底物的最适pH为3.0;Al3+和Fe3+是该酶的强效催化剂,Fe2+是该酶的强效抑制剂;H2O2在低浓度范围内(0~16mM)可促进酶活;低浓度乙醇(0~16%)的添加对酶活无明显抑制作用。(4)酶解产非香气物质的测定。利用高效液相色谱研究不同底物生成的非香气物质随酶解时间、pH、温度的变化规律,结果表明非香气物质生成量会随着酶解时间的增加、pH的降低和温度的升高出现先增加后减少的趋势。另外发现β-胡萝卜素在不同反应pH下可生成不同的裂解产物。利用二次多项式逐步回归得到酶解的最佳工艺条件,β-胡萝卜素、玉米黄质、β-阿朴-8’-胡萝卜醛、角黄质和虾青素的酶解条件分别为反应pH值为4.5、反应温度30℃、反应时间15min;pH 4.5、温度30℃、反应时间13min;pH4.5、温度33℃、反应时间45min;pH 4.0、温度30℃、反应时间41min;pH 4.5、温度50℃、反应时间7min。利用HPLC纯化非香气物质,经LC-APCI+/MS鉴定,β-胡萝卜素酶解生成的非香气物质为β-胡萝卜素-5,6-环氧化物和β-胡萝卜素-5,8-环氧化物,玉米黄质酶解生成的产物为阿朴-10’-玉米黄质-5,6-环氧化物和玉米黄质环氧化物,β-阿朴-8’-胡萝卜醛酶解生成的产物为阿朴-8’-胡萝卜素醛-5,6-环氧化物,阿朴-10’-角黄质-5,6-环氧化物和角黄质环氧化物为角黄质酶解所得,阿朴-10’-虾青素-5,6-环氧化物和虾青素环氧化物为虾青素酶解所得。(5)酶解产香气物质的测定。利用GC-MS检测该类胡萝卜素裂解酶催化底物降解产生的香气物质,结果表明所得纯酶催化β-阿朴-8’-胡萝卜醛和β-胡萝卜素产生的香气物质主要是β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮-5,6-环氧化物、β-环柠檬醛,还有少量的二氢猕猴桃内酯和2,6,6-三甲基环己酮;所得纯酶催化玉米黄质、角黄质和虾青素底物产生的香气物质分别是3-羟基-β-紫罗兰酮、3-氧-β-紫罗兰酮和α,β-二氢-β-紫罗兰酮香气物质,其中该酶催化虾青素裂解为“天然”香气物质α,β-二氢-β-紫罗兰酮的制备提供了另一种有效途径。综合香气物质和非香气物质可推断出该酶作用于β-阿朴-8’-胡萝卜醛和β-胡萝卜素底物的作用位点是C9-C10/C9’-C10’和C7-C8/C7’-C8’;其作用于叶黄质类底物的作用位点是C9’-C10’双键位置。