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目的:复苏低温冻存的人退变髓核细胞,并观察其活力;体外筛选最佳Fas-si RNA并构建其慢病毒载体;Sox9、Fas及Sox9联合Fas体外转染人退变髓核细胞,并研究它们在体外对人退变髓核细胞的影响。方法:复苏液氮储存的人退变椎间盘髓核细胞,对细胞进行培养,并观察其活力情况。设计Fas-si RNA-慢病毒载体,经酶切和基因测序鉴定重组克隆,对Fas-si RNA进行慢病毒包装,并检测其滴度。将Sox9过表达和Fas干扰以慢病毒为载体在体外联合转染人退变髓核细胞进行实验研究,为了便于荧光显微镜观察病毒转染效率,用红色荧光标记Sox9基因,蓝色荧光标记Fas基因。实验分为(1)空白对照组;(2)阴性对照组;(3)Sox9过表达组;(4)Fas干扰组;(5)Sox9过表达+Fas干扰组。携带目的基因的慢病毒转染人退变髓核细胞72h后,通过荧光显微镜观察,而检测病毒转染效率;CCK8检测各组细胞增殖情况;RT-PCR检测各组Sox9、Fas、Ⅱ型胶原、蛋白多糖在m RNA水平的表达情况;Western-Blot分别检测各组Ⅱ型胶原、蛋白多糖在蛋白质水平的表达。结果:人退变髓核细胞成功复苏培养后,细胞生长正常、状态良好。经酶切及重组克隆基因测序鉴定显示,应用基因重组技术成功构建Fas-si RNA慢病毒载体,检测滴度大于1x108TU/ml。荧光显微镜观察72h后(3)、(4)、(5)组的载体转染人退变髓核细胞其转染效率均达到80%以上。CCK8检测结果显示与(1)组相比(2)组细胞增殖变化不大,比较差异无统计学意义(P>0.05);(3)组、(4)组、(5)组与(1)组相比细胞增殖率均有明显增高,其中(5)组的细胞增殖率增高最为显著,比较差异有统计学意义(P<0.05)。运用RT-PCR检测方法证实在Sox9、Fas、Ⅱ型胶原和蛋白多糖m RNA表达水平上(1)组与(2)组相比变化不大,比较差异无统计学意义(P>0.05);(3)组中Sox9的m RNA表达升高明显,(4)组中Fas的m RNA表达水平降低明显,(5)组中Sox9的m RNA表达水平升高最为显著、Fas的m RNA表达水平降低最为显著,与(1)组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。Western-blot检测结果表明与(1)组相比(2)组Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达变化不明显,比较差异无统计学意义(P>0.05);(3)组、(4)组Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达均有明显升高,(5)组升高最为显著,与(1)组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:慢病毒介导的Fas-si RNA可以显著抑制人退变髓核细胞中Fas基因的表达;上调Sox9基因的表达及沉默Fas基因的表达能够增加人退变髓核细胞外基质Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达量,实验结果显示Sox9和Fas基因与椎间盘退变有相关性,通过此生物学效应有望阻止或逆转椎间盘退变。