目的依据网络药理学的思想,采用转录组学RNA-Seq技术与代谢组学核磁共振技术联合应用的方法,从基因调控的角度、代谢产物表达层面研究芪参颗粒治疗冠心病心功能不全气虚血瘀证的可能存在的有效的药物靶点和效应机制通路,并进一步探索中药复方对证治疗冠心病心功能不全可能的药理机制,为中药新药开发,寻找有效地多靶点药物治疗,提供了坚实的基础。方法1、采用左冠脉前降支主干放置Ameroid缩窄环法复制小型猪冠心病心功能不全气虚血瘀证动物模型,以假手术组作为对照组,并在术后3周对模型动物进行评价,并给予对证中药复方芪参颗粒高、中、低剂量组、以及已经上市的西药阳性药地高辛、中药阳性药芪参益气滴丸进行治疗,从疾病、证候、主要症状、理化指标多个层面对其药效结果进行动态观察和系统评价。2、采用代谢组学核磁共振技术,对模型组、假手术组、芪参颗粒高剂量组给药后8周血清样本中的内源性小分子代谢物进行全面的鉴定和差异性比较分析,并试图寻找芪参颗粒治疗冠心病心功能不全的可能存在的代谢通路,或药效作用机制。3、采用转录组学RNA-Seq技术,对模型组、假手术组、芪参颗粒高剂量组缺血边缘区心肌组织进行基因测序并寻找差异基因,从基因调控的角度、表达模式聚类、GO功能分类、Pathway、网络相互作用层面研究芪参颗粒治疗冠心病心功能不全的可能存在的有效的药物靶点和效应机制通路,并进一步探索中药复方对证治疗冠心病心功能不全可能的药理机制,并对其提示的关键分子节点和效应机制通路进行分子生物学方法的验证。结果1、给药前,各组动物表现无差异;给药后2、4、8周,模型组小型猪活动度有所恢复,但对外界刺激反应迟钝,挣扎无力,皮毛逐渐失去光泽,毛发杂乱,摇尾次数减少,饮食量饮水量下降;其余各组动物症状均有改善2、给药前,心功能不全模型动物气虚血瘀证积分显著升高,与假手术组比较存在显著性差异(P<0.05或P<0.01),给予药物治疗后,各治疗组动物证候积分逐渐下降,至给药后8周,与模型组比较存在显著性差异(P<0.05或P<0.01)。3、给药前,模型组动物舌色度与假手术组比较存在显著差异(P<0.05或P<0.01),给药后芪参益气滴丸组和芪参颗粒高中低剂量组均有不同程度的改善(P<0.05或P<0.01)。4、血液流变学检测指标结果显示,给药前,模型动物不同切变率下全血粘度、还原粘度及血细胞聚集指数出现不同程度增高(P<0.05或P<0.01);给药后8周,各药物组不同切变率下全血粘度和血浆粘度均有改善(P<0.05或P<0.01)。5、超声心动图结果显示,给药前,模型动物LVSV显著增加(P<0.05)、LVEF显著下降(P<0.01),FS 显著下降(P<0.05);LVSV、LVDV 显著增加(P<0.05 或 P<0.01)。给药后2周,地高辛组、芪参颗粒高组LVSV、LVDV显著增加(P<0.05或P<0.01),LVEF显著下降(P<0.01)。给药后4周,地高辛组、芪参益气滴丸组、芪参颗粒高组LVSV显著增加(P<0.05),LVEF显著下降(P<0.01)。给药后8周,地高辛组、LVSV显著增加(P<0.05),LVEF显著下降(P<0.01);芪参益气滴丸组、芪参颗粒高组LVEF显著下降(P<0.05或P<0.01)。模型组随病程发展,各指标不同程度的下降。6、血流动力学检测发现,给药后8周,与假手术组相比,模型组小型猪的SBP和DBP以及MAP明显下降(P<0.01);而芪参颗粒组和阳性药组均能很好的改善动脉的SBP和DBP,并能有效的提高动脉MAP(P<0.01)。在心室血流动力学方面,模型组小型猪的LVSP、LV+dP/dt max和LV-dP/dt max低于假手术组,芪参颗粒各组和阳性药组均能上调心衰小型猪的LVSP、LV+dP/dtmax和LV-dP/dtmax,进而改善心衰小型猪的心室血流动力学状况。7、心脏体重比方面,心功能不全小型猪的心脏体重指数明显高于假手术组;给药各组的心脏体重指数均有改善,其中以芪参颗粒高剂量组改善较为明显;阳性对照药对心肌重塑方面的改善并不明显。8、给药后8周,模型组小型猪血清中肌钙蛋白T(cTNT)、心房钠尿肽(BNP)上升,模型组小型猪的血清BNP明显高于假手术组;芪参颗粒各剂量组和地高辛组能够明显的降低心衰小型猪血清BNP水平(P<0.05)。给予芪参颗粒后有效降低小型猪血清中上升的心肌酶类;同时阳性对照药在心肌酶调节方面也有相应的改善。9、HE染色可见,模型组小型猪心肌细胞排列紊乱,大量心肌细胞坏死、丧失正常结构,发生肌纤维溶解;地高辛组细胞排列紊乱,细胞间隙增大,边界模糊;芪参益气滴丸组,心肌细胞排列紊乱,边界不清,部分细胞呈现核固缩等表现;芪参颗粒高剂量组心肌细胞排列较为整齐,细胞基本维持原有形态,部分新生细胞出现;芪参颗粒中剂量组心肌细胞排列稀疏,肌纤维较为整齐;芪参颗粒低剂量组心肌细胞失去形态,细胞形状发生改变,部分细胞核聚集。10、Masson染色可见,模型组,心肌细胞被胶原纤维组织代替并呈弥漫性、浸润性分布,血管周围呈现聚集性分布等特点;地高辛组心肌细胞间隙大量胶原沉积,局部呈现聚集性等特点,部分细胞间隙扩大,边界不清;芪参益气滴丸组镜下可见大量胶原沉积,弥漫性分布,散布于细胞间隙及血管周围;芪参颗粒高剂量组存在少量胶原组织分布,胶原沉积数量少于中、西药对照组;芪参颗粒中剂量组可见部分胶原沉积,血管区周围聚集较多;芪参颗粒低剂量组心肌细胞间散在大量胶原组织,呈现弥漫性、侵润性等特点分布。11、模型组、芪参颗粒高剂量组、假手术组血清1H-NMR图谱发现共有差异性代谢物质25种,包括组氨酸、乙酰乙酸、乙酸、乙醇、缬氨酸、天冬氨酸、糖蛋白、脯氨酸、柠檬酸、尿素、马尿酸、亮氨酸、赖氨酸、肌酸酐、肌醇、琥珀酸、甘油、二甲基甘氨酸、二甲胺、蛋氨酸、胆碱、苯丙氨酸、b-羟丁酸、b-葡萄糖、1-甲基组氨酸。给药后8周,与假手术组相比,模型组中糖蛋白、肌酸酐、二甲基甘氨酸、b-羟丁酸上调表达差异显著;乙酰乙酸、乙酸、缬氨酸、脯氨酸、尿素、二甲胺下调表达差异显著。给药后8周,与模型组相比,给药组中乙酰乙酸、乙酸、乙醇、脯氨酸、尿素、1-甲基组氨酸上调表达差异显著,二甲基甘氨酸下调表达差异显著。12、RNA-Seq结果显示Model VS Control,上调基因有90个,下调基因有4个;Treatment VS Model,上调基因 12 个,下调基因 14 个。Model VS Control 与 Treatment VS Model中共有的差异基因为10个。Model VS Control,其KEGG通路主要为:p53信号通路、白细胞跨内皮迁移、原发性免疫缺陷、细胞粘附分子等。Treatment VS Model,其KEGG通路主要为脂肪酸生物合成、补体及凝血级联反应、肾素-血管紧张素系统。并且依据差异基因表达情况得到GO分类、聚类模式及网络相互作用提示。13、分子生物学验证提示与假手术组相比,模型组及给药各组在JAK2、STAT3、HIF-1-α、NOX2、NOX4基因表达水平上均有不同程度的升高;在AC02、MDH、IDH、PPAR-Y表达水平上有不同程度的降低。结论1.中药复方芪参颗粒能够有效改善Ameriod缩窄环致心功能不全小型猪气虚血瘀证宏观体征,改善心功能以及相关理化指标。2.1H-NMR代谢组学结果提示芪参颗粒治疗心功能不全气虚血瘀证小型猪主要代谢物集中在氨基酸代谢、糖代谢和能量代谢等方面,对于指导临床用药、寻找新的药物靶点、药效作用机制有一定的提示作用。3.RNA-Seq转录组学结果提示芪参颗粒治疗心功能不全气虚血瘀证小型猪的主要药理通路可能与能量代谢障碍、氧化应激损伤密切相关。