【摘 要】
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漆酶是一种在多个领域具有广泛应用价值的多酚氧化酶,但其应用受产酶效率低的限制。实验室前期选育获得一株高产漆酶齿毛菌Cerrena sp.HYB07菌株,该菌株中的漆酶基因Lac7能够
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漆酶是一种在多个领域具有广泛应用价值的多酚氧化酶,但其应用受产酶效率低的限制。实验室前期选育获得一株高产漆酶齿毛菌Cerrena sp.HYB07菌株,该菌株中的漆酶基因Lac7能够高效表达。为实现漆酶高效表达,本课题构建了含Lac7启动子的新型漆酶表达系统。主要研究结果如下:1.以0.6 mol/L甘露醇做稳渗剂,以2%的溶壁酶30 ℃酶解48 h菌龄的菌丝3h,所得齿毛菌原生质体形成数最多,为1×108个/mL;所得原生质体在0.8 mol/L蔗糖做稳渗剂的2号培养基中的再生率最高,为1‰。2.从再生原生质体中筛选获得两株单核菌,分别为12-12-34和11-10-9。12-12-34的最高酶活力为355.26 U/mL;而11-10-9最高酶活力仅为11.60 U/mL。分析漆酶同工酶基因,表明两个单核菌株均具有13条漆酶同工酶基因。分析两个单核菌株中Lac7和Cuf1基因的表达量,发现12-12-34中Lac7和Cuf1基因的表达量分别是11-10-9中的54.684倍和0.49倍。为获得低漆酶背景,但具备高效表达系统的漆酶表达宿主,构建了以同源替换方式敲除Lac7基因的敲除载体pGK02-UP2000+Hyg+PD1500,并对单核菌株中的Lac7基因实施敲除。但由于转化效率低,时间有限未能筛选到基因敲除突变子。3.分别构建含Lac7启动子和35S启动子的漆酶表达载体,将Cerrena sp.HYB07菌株中的Lac7基因在Cerrena unicolor 5.1011菌株中进行异源表达。获得3株由重组载体pCAMBIA1302-Lac7(P-cDNA)转化而来的阳性转化子PC1、PC5和PC7;发酵22 d时酶活力分别为93.22 U/mL、98.15 U/mL 和 100.59 U/mL,是受体菌株 5.1011 的 2.68 倍、2.82 倍和 2.89 倍。获得4株由重组载体pCAMBIA1302-Lac7(35S-I+T)转化而来的阳性转化子IT2、IT3、IT4 和 IT5;发酵第 4d 时酶活力分别为 3.65 U/mL、2.84U/mL、1.22 U/mL 和 1.56 U/mL,是 5.1011 菌株的 17.09 倍、13.32 倍、5.70 倍和7.29 倍。本课题成功建立了含Lac7强启动子的新型漆酶丝状真菌表达系统。为实现漆酶高效表达提供理论依据,亦为齿毛菌的遗传操作及分子生物学研究奠定基础。
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