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肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC),简称肾癌,是泌尿系统位列第二的肿瘤,在成人恶性肿瘤中所占比例约为3%,其中最常见的病理类型为透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC),约占全部肾细胞癌的75%。30%的肾细胞癌患者在初诊时已进入进展期和发生转移。进展期或转移的患者五年生存率很差,可能是发生了转移和耐药。因此,探讨肾脏透明细胞癌发病机理并寻找有效的治疗方法至关重要。NLRC5(NLR family,CARD domain containing 5)是最新发现的NLRs(NOD like receptors)家族成员,NLRC5可通过NF-κB、I型干扰素(IFN-I)及MHC-I基因的表达来参加机体的炎症和免疫的调节,尤其是与肿瘤的发生和发展关系密切。本课题组之前发现NLRC5在肝癌的组织及细胞中高表达,通过正向调控Wnt/β-catenin信号通路调节肝细胞癌的细胞增殖,侵袭和迁移。而其在透明细胞肾细胞癌中的研究至今未见报道。本研究中,来自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库显示,NLRC5在透明细胞肾细胞癌组织中表达高于正常组织,并且NLRC5的表达量与患者生存预后和临床分级密切相关。随后,本实验进一步探讨了NLRC5对透明细胞肾细胞癌细胞系的增殖、侵袭和迁移能力的影响,并初步探讨其可能作用机制。方法1.首先从TCGA数据库中提取透明细胞肾细胞癌患者RNA-seq数据分析,分析癌组织和癌旁组织中NLRC5基因(mRNA)差异,并进一步探讨了NLRC5基因表达与患者临床分级和预后的相关性。2.从收集人肾透明细胞癌组织和癌旁正常肾脏组织,RT-PCR,Western blotting和免疫组织化学染色法检测人肾透明细胞癌组织中NLRC5的表达变化。同时利用Western blotting和RT-PCR检测人类正常肾小管上皮细胞HK-2和三种肾癌细胞株Caki-1、786-O和769-P中NLRC5的表达水平。3.采用转染试剂LipofectaminTM 2000将过表达的pEGFP-C3-NLRC5重组质粒和沉默NLRC5的小干扰RNA转入786-O和769-P细胞系中,RT-PCR和Western blotting检测NLRC5的mRNA和蛋白表达水平。4.采用CCK-8、流式细胞术、Transwell迁移侵袭实验及相关蛋白表达进行体外细胞功能分析,同时观察NLRC5表达变化对肾透明细胞癌细胞系中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响。5.将细胞分为两组NC细胞(786-O)和稳定低表达NLRC5细胞(786-O),将5×10~6/200μl细胞注射于裸鼠右前肢腋下,每周测量肿瘤体积,第八周处死裸鼠,剥取肿瘤,称量肿瘤重量,并检测两组肿瘤相关蛋白。结果1.TCGA数据库结果表明,与正常组织相比,癌组织中NLRC5的mRNA水平显著升高,高表达NLRC5患者较低表达患者预后生存差,并且等级为T3-T4的患者NLRC5表达水平明显高于T1-T2的患者。2.肾透明细胞癌组织的NLRC5蛋白和mRNA表达明显高于癌旁组织,肿瘤细胞系中NLRC5蛋白和mRNA水平也高于正常的肾小管上皮细胞HK-2。3.Western blotting和RT-PCR实验结果表明瞬时低表达或高表达NLRC5的细胞系转染成功。4.过表达NLRC5能明显加强786-O和769-P细胞增殖、侵袭和与移能力,同时Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白β-catenin、c-Myc和cyclinD 1蛋白水平表达量显著升高。沉默NLRCS可明显抑制786-O和769-P细胞系增殖、迁移与侵袭能力,同时也负向调控Wnt/β-catenin信号通路。5.低表达NLRC5组肿瘤的生长较NC对照组慢,第八周剥取的肿瘤重量也较NC组轻,Western blotting结果表明低表达NLRC5组肿瘤中MMP2,MMP9,PCNA,β-catenin,c-Myc和cyclinD1蛋白比对照组NC低。结论NLRC5通过靶向Wnt/β-catenin信号通路促进透明细胞肾细胞癌增殖、迁移和侵袭功能。