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Wolbachia是一类广泛分布于昆虫中的细胞内共生菌,它能够通过多种方式影响宿主的生殖,如诱导昆虫宿主产生精卵细胞质不亲和(C1)、孤雌生殖、杀雄和雌性化,借此来扩张Wolbachia种群数量。其中CI是最为常见的一种表型,即Wolbachia感染的雄性与未感染或感染不同品系Wolbachia的雌性宿主交配会导致后代胚胎致死。而感染相同品系Wolbachia的雌性与雄性交配后则能产生含有Wolbachia的正常发育的胚胎。尽管Wolbachia诱导CI的分子作用机制还不很清楚,但近年来许多研究结果都显示,Wolbachia会以某种方式对宿主精子进行修饰,这种修饰抑制了父本染色体在合子核分裂时进入分裂后期,因而导致胚胎发育停滞。本研究组前期通过微阵列(microarray)分析发现,Wolbachia感染导致果蝇3龄幼虫精巢中296个基因的表达水平发生了至少1.5倍以上(P<5%)的变化,其中167个基因表达量发生上调,129个基因表达量发生下调。本研究首先选取了4个microarray中存在显著差异表达的基因,kenny, Adh, CG12262-RA和CG4988-RA进行qRT-PCR检测,证实了这些基因在感染与未感染Wolbachia的果蝇3龄幼虫精巢中确实存在显著的表达量差异。此外,我们还用原位杂交技术进一步验证kenny和CG4988-RA基因在感染与未感染Wolbachia的果蝇3龄幼虫精巢中的表达差异,结果显示kenny探针在感染Wolbachia的精巢中杂交信号明显增强,且集中分布于精巢的某些区域。CG4988-RA在感染Wolbachia的精巢中信号明显减弱且成弥散状分布。为进一步探寻这些差异表达的基因是否与CI的作用机制有关,本研究选取了kenny、 CG12262-RA、JhI-26和Dbi这4个已被证实在感染Wolbachia的果蝇3龄幼虫精巢中表达量上调的基因来研究其在果蝇发育和生殖中的功能。我们首先通过qRT-PCR分析了上述基因在果蝇中的时空表达图式,发现这些基因在成年雄性生殖腺中表达水平都较高,推测这些基因可能参与了雄性果蝇生殖的过程。通过胚胎显微注射的方法,分别建立了带有上游激活序列(UAS)的转基因果蝇品系:UAS-kenny-RA, UAS-CG12262-RA, UAS-Dbi-RA, UAS-JhI-26-RA和UAS-CG10433-RA,并通过遗传杂交方法进行染色体平衡和定位。将这些果蝇雄体与带有不同驱动子的Gal4品系雌体进行交配,运用UAS-GAL4系统将上述5个基因在精巢或全身广泛过量表达。我们选取了UAS-kenny-RA, UAS-CG12262-RA, UAS-Dbi-RA和UAS-JhI-26-RA过量表达的雄蝇与未感染Wolbachia的雌蝇交配,发现1日龄基因过量表达的雄蝇都能够导致不同程度的后代胚胎致死现象。因此我们推测这些基因在雄蝇中上调表达可能与CI的机制有关。JhI-26(Juvenile hormone-inducible protein26)是一种保幼激素(JH)诱导蛋白,能够被保幼激素及其类似物快速诱导表达。近来Jhl-26已被鉴定为果蝇的精子蛋白之一。前期microarray和原位杂交结果都显示,Wolbachia感染的3龄幼虫精巢中JhI-26-RA表达显著上调,qRT-PCR结果显示JhI-26-RA上调幅度最大,达到12倍以上,因此推测Wolbachia可能影响了果蝇体内保幼激素(JH)信号通路。由于Jhamt基因编码JH酸甲基转移酶,在JH合成过程中起关键作用:Met(methoprene-tolerant)被认为最有可能是保幼激素的受体,因此,为研究Wolbachia感染是否影响JH信号通路,我们比较了Wolbachia感染和未感染果蝇精巢中Jhamt和Met基因的表达水平,发现Jhamt和Met的表达在Wolbachia感染的果蝇精巢中发生显著上调,说明Wolbachia感染增强了果蝇保幼激素信号通路。然后我们检测了JhI-26-RA过量表达的雄性果蝇的繁殖力,胚胎孵化率结果显示,JhI-26基因无论是在精巢中过量表达,还是广泛过量表达,其1日龄雄蝇所产后代胚胎中,孵化率仅分别为32.2±1.26%、46.97±3.30%,都极显著低于对照组。而感染Wolbachia的雌蝇则能够挽救这种胚胎致死表型。这一结果说明,就胚胎孵化率而言,JhI-26过量表达的雄蝇能够产生类似CI的表型。Wolbachia可能通过JhI-26来作用于果蝇保幼激素信号通路,并进一步影响雄性果蝇的生殖力。已有研究表明,JhI-26在果蝇成蝇的雄附腺中大量表达,暗示其与雄附腺蛋白可能存在相互作用。由于本研究组前期在1nicroarray分析时,发现一种雄附腺蛋白编码基因CG10433在Wolbachia感染时发生显著上调,因此我们分析了JhI-26和CG10433之间的关系,发现JhI-26基因过量表达的果蝇中CG10433基因表达显著上调,而在CG10433过量表达的雄蝇中,JhI-26的表达水平并无发生显著变化。说明JhI-26可能在CG10433的上游发挥作用。通过研究JhI-26和CG10433雄蝇与正常雌蝇交配后所产胚胎的发育情况,发现JhI-26和CG10433过量表达的雄蝇均会导致后代胚胎在发育早期产生核分裂异常的表型,主要表现为纺锤体变窄、中心体与纺锤体分离、后期分离开的染色体之间出现成对微管小体等。由于有文献表明,雄附腺蛋白会影响雌性昆虫的交配后效应,其中包括导致交配后的雌蝇拒绝接受再次交配。为探讨Wolbachia感染是否会通过JhI-26和CG10433对果蝇交配后效应产生影响,我们用Wolbachia感染的雄果蝇、JhI-26过量表达和CG10433过量表达的雄果蝇与正常雌果蝇交配后,留雌果蝇单独饲养3天,再配以雄果蝇,观察8h内雌蝇接受再次交配的情况。结果发现,与正常雄蝇交配后的雌蝇(对照组)在8h内有80%接受了再次交配,而与Wolbachia感染雄果蝇交配后的雌蝇完全拒绝再次交配。令人惊讶的是,与JhI-26过量表达雄果蝇交配后的雌蝇也完全拒绝接受再次交配,与CG10433过量表达雄果蝇交配后的雌蝇中只有45%接受了再次交配。说明Wolbachia感染对果蝇交配后效应产生严重影响,该影响可能也是通过保幼激素通路实现的。综上所述,我们提出了一个新的Wolbachia与果蝇宿主相互作用的途径,即Wolbachia能在果蝇精巢中通过某种方式增强Jhamt基因表达,JHAMT帮助保幼激素酸转化为保幼激素。保幼激素通过其可能的受体Met来快速诱导JhI-26基因表达,然后诱导CG10433基因上调表达,CG10433上调表达导致产生雄性生殖缺陷。根据上述作用途径本研究提出了一个新的假设,即Wolbachia可能通过作用保幼激素应答基因JhI-26和CG10433影响了保幼激素通路,为深入探究Wolbachia与宿主之间相互作用的机制提供了新思路。