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芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）以不对称分裂的方式繁殖,纺锤体定位是保证命运决定因子通过细胞分裂精确分配到子细胞中的关键一环。已知Kar9与Dynein两条通路共同控制有丝分裂纺锤体的定位。Num1是一个在Dynein通路中发挥重要作用的膜蛋白,它为从胞质微管正端卸载到细胞膜上的动力蛋白Dynein提供细胞膜上的锚着点,便于其通过微管产生拉力定位纺锤体。已有不少研究报道了Num1的分子结构和功能,但其调节机制还不甚明了。本研究分别从Num1的互作蛋白Sik1在纺锤体定位中的功能及解析Num1蛋白的磷酸化出发,探索Num1蛋白在纺锤体定位中的调节机制。Num1是一个分子质量为313 kD的多结构域大分子蛋白,为了通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Num1蛋白的磷酸化,我们在电泳中使用了Phos-tag且在凝胶中加入0.5%的琼脂糖,成功使磷酸化和非磷酸化的Num1在电泳中分开。主要分析结果如下:1)全长Num1蛋白是一个磷酸化的蛋白,缺失其N末端、C末端、CC结构域及CC结构域和PH结构域之间的一大段序列均不同程度地影响其磷酸化。2)用α-factor,羟基脲,Nocodazole及酵母的温度敏感型突变体cdc5-2,cdc15-2和cdc14-1将细胞分别停滞在G1期、S期、G2-M期、晚后期和末期（cdc15-2和cdc14-1二者停滞的时间相近）,检测Num1的磷酸化,结果表明Num1的磷酸化在细胞周期中呈现动态变化:在G1-S期表现为高度磷酸化,G2-M期至晚后期为非磷酸化,晚后期到末期重新出现磷酸化。3)为了探索蛋白激酶Cdc5在Num1磷酸化中是否扮演角色,用cdc5-2温度敏感型突变体检测了灭活Cdc5对Num1磷酸化的影响。与野生型细胞相比,同步化于G1期的cdc5-2细胞在释放于37℃后的50～150 min时段内Num1-GFP的磷酸化水平低于野生型,说明Cdc5可能是负责在这个阶段磷酸化Num1的激酶。Sik1（Suppressors of IκB）是本实验室前期通过Pull-down实验结合质谱分析筛选出的Num1的互作蛋白。虽然是一个保守的核仁蛋白,但有报道显示过表达SIK1可导致纺锤体定位缺陷。本研究从以下几方面探索了Sik1在纺锤体定位中的作用:首先,构建了单独过表达SIK1或同时过表达SIK1和NUM1的菌株GAL1p-3HA-SIK1及GAL1p-3HA-SIK1 GAL1p-NUM1-YFP,通过免疫共沉淀实验证实了Num1和Sik1在细胞内存在互作关系。其次,检测了过表达SIK1对纺锤体定位和核迁移的影响。过表达SIK1导致M期前纺锤体沿母-芽细胞极轴的平行排列出现一定角度的偏离。经测量,GAL1p-3HA-SIK1细胞中纺锤体与母-芽轴之间的夹角β平均值为48.0°（48.0±29.7°）,而野生型菌株的β平均值为32.4°（32.4±24.5°）,二者存在显著差异（P0.001）。但是,通过观察DAPI染色后的细胞核,未能在GAL1p-3HA-SIK1菌株中发现双核细胞,说明过表达SIK1导致纺锤体定位出现一定程度的缺陷,但不足以导致双核细胞的形成。然后,检测了过表达SIK1对Kar9和Dynein通路突变体生长的影响。通过分别比较num1Δ、GAL1p-3HA-SIK1、num1ΔGAL1p-3HA-SIK1、kar9Δ、kar9ΔGAL1p-3HA-SIK1及野生型细胞在30℃、16℃和37℃下的生长,发现16℃低温胁迫条件下各菌株表现出生长差异。过表达SIK1削弱了kar9Δ细胞的活力,却能部分恢复num1Δ细胞的活力,表明Sik1可能参与Dynein/Num1通路的调控。最后,检测了过表达SIK1对Dynein从胞质微管正端卸载到细胞膜的影响。通过对比WT、GAL1p-3HA-SIK1、num1Δ细胞中胞质微管正端的Dyn1/DHC-3GFP荧光信号的聚焦强度,发现过表达SIK1导致Dynein在胞质微管正端聚集,和敲除NUM1类似。GAL1p-3HA-SIK1细胞中胞质微管正端Dyn1/DHC-3GFP的平均荧光强度为1.9×10~4（A.U.）,低于num1Δ细胞中的2.6×10~4（A.U.）,但与野生型细胞中的1.1×10~4（A.U.）存在显著差异（P<0.001）,说明过表达SIK1干扰Dynein从胞质微管正端到细胞膜的卸载。综上,本研究确认了全长Num1蛋白在细胞周期中的磷酸化,初步证明Cdc5可能是参与磷酸化的一个蛋白激酶。同时,一系列实验证据表明Sik1参与Dynein通路调控纺锤体定位,包括:Sik1蛋白与Num1存在体外和体内相互作用,过表达SIK1导致纺锤体定位缺陷,且影响Dynein从胞质微管正端的卸载。此外,低温胁迫条件下的细胞生长实验证实SIK1与NUM1之间存在遗传互作。这些结果为进一步解析Dynein通路控制纺锤体定位的分子机制奠定了良好基础。