研究目的及意义：目前原位器官移植是治疗器官衰竭唯一有效的方法。在美国每年大约有27000人因肝脏衰竭死亡,然而对于合适器官移植的需求远远超过了可利用的器官供体的数量,这一短缺促进了一些新的技术发展,这些技术以组织工程和再生医学为基础旨在创造出可移植的实质性器官。最近几年在组织工程和再生医学领域出现一些明显进步,有功能的组织和器官已经在体外被创造,并且成功地被移植入受体。一些工程性组织及器官例如血管、膀胱、角膜及气管已有了明显的进步。以上的这些器官不依赖大的脉管系统就能表达功能,然而像肝脏、肾脏、肺及心脏就需要足够的血流量来维持其功能。如何产生保留着能供应营养物质和氧气交换的完整脉管系统的大型器官是一大挑战。解决这难题的一个很好办法就是利用自然的实质器官以获得包含着管道网络的完整结构。将实质器官进行去细胞化就可以得到这样一个结构,这种方法不仅去除了大量的细胞和核性物质,还保留三维的细胞外基质结构。一些组织例如心瓣膜、小肠黏膜下层已成功地通过去细胞化得到了相对简单的细胞外基质。这些研究结果显示去细胞方法不仅能应用产生简单组织的细胞外基质,还能将具有复杂结构的器官去细胞形成细胞外基质。对于大型并具有复杂结构的器官,以灌注为基础的去细胞方法已成功应用心脏、肝脏、肺及肾脏；这种方法不仅能够去除细胞及核性物质,还保留三维的细胞外基质结构及完整的脉管系统。因引起免疫反应的细胞及细胞内成分的完整去除,保留的三维生物支架结构可安全地用于器官的移植。目前,有很多不同的方法应用于整个器官的去细胞,比较常见的方法包括物理、酶以及化学剂。然而影响组织和器官去细胞的因素有多种包括：1.器官本身的结构特点,包括细胞或组织的密度、器官脂质的含量及组织和器官的厚度2.选择的去细胞剂的性质和特质3.灌注技术的一些物理参数在灌注去细胞过程中也是尤为重要的一环。就现在而言,对于不同种属的肝脏已有多种灌注去细胞方法应用于制备去细胞化肝脏支架,主要以SDS和Triton x-100在去细胞过程中应用地最为广泛；SDS为离子型去细胞剂,能溶解细胞质及细胞核膜,能有效地去除组织中的细胞及细胞成分包括(细胞核性残留物和细胞质内蛋白),并保持胶原成分但容易破坏蛋白之间的相互作用；非离子去细胞剂以Triton X-100为代表,它破坏了脂肪链间和脂蛋白间的相互作用,保存了蛋白与蛋白间的相互作用,去细胞效果相对SDS较弱。然而对于灌注技术中一个重要的物理参数即灌注流速确鲜有具体的研究。那么如何根据以上的一些影响因素来选择适宜的制备去细胞化肝脏支架的方法,才能达到完全去除器官内细胞、细胞内成分及核性物质,并最小化地破坏细胞外基质,以便为再细胞化提供近似于体内的生长微环境的目的,这一点显得尤为的重要,也需要我们进行进一步的探讨。因此在本次研究中,我们使用了不同浓度SDS (0.75%SDS、0.5%SDS、0.25%SDS)以及不同浓度Triton X-100(1%Triton X-100、2%Triton X-100、3%Triton X-100)均以5ml/min的灌注流速对大鼠肝脏进行脱细胞,并对以上浓度的去细胞剂灌注下所产生的生物支架进行成分、结构以及对细胞的增殖作用等方面的比较,得出较其他组别有一定优势的一组,并进一步关注灌注流速对于去细胞效果的影响将所得到最有优势的处理组用不同灌注流速(3ml/min、5ml/min、7ml/min、10ml/min)进行脱细胞,进行综合比较后,得出较有优势的一组,确定最具优势的脱细胞剂及其灌注流速,从而获取一种适宜的灌注去细胞方法。实验方法：1.实验分组及大鼠去细胞肝脏支架模型制作SPF级2月龄SD大鼠50只(雌雄不限),质量约200～300 g,将这些大鼠每5只一组随机分成7个组,包含6个实验组和1个对照组,其中6个实验组由6种去细胞方法构成；根据6种方法综合比较后的结果,将该方法以不同的流速进行灌注,将每5只大鼠一组随机分入4个灌注流速亚组(3ml/min、5ml/min、7ml/min、 10ml/min)。所有大鼠均以水合氯醛(0.4ml/100g)及肝素钠(2m1)腹膜下注射麻醉；大鼠麻醉后,按一下步骤操作：1.打开腹腔,游离肝脏周围韧带；2.找到并游离门静脉,并经门静脉插管固定后依次灌注500ml冲洗液(1XPBS+0.02%EDTA+2ml肝素钠),从而冲洗肝脏内血液及防止血栓形成的目的；3.切断下腔静脉,将其作为液体流出道灌注后；4.将肝脏移出大鼠体内,将行灌注去细胞；2.石蜡组织包埋及切片将正常肝脏组织和去细胞的肝脏支架切成小片,每组取一个样本,用4%多聚甲醛固定12小时；固定好的样本按照常规石蜡标本包埋方法进行制作石蜡标本,石蜡组织切片机切片,切片厚度5 um。3.免疫荧光免疫荧光检测正常肝脏组织和各组去细胞肝脏支架中collagen Ⅰ、 collagen Ⅳ、Laminin、Elastin及fibronectin等五种胶原蛋白的分布4.电镜检测扫描电镜观察各组去细胞肝脏支架内的三维微结构5.DNA定量检测利用DNA定量试剂盒检测正常肝脏组织和各组去细胞肝脏支架中的DNA的残留量。6.GAGs定量检测利用GAGs定量试剂盒检测正常肝脏组织和各组去细胞肝脏支架中的GAGs的残留量。7.细胞毒性检测利用MTT试剂检测各组去细胞肝脏支架的浸泡液和对照组对C3A细胞的细胞毒性。8.灌注流速亚组间的DNA和GAGs定量检测根据6种方法综合比较后的结果,将该方法以不同的流速进行灌注,将每5只大鼠一组随机分入4个灌注流速亚组(3ml/mim、5ml/min、7ml/min、10ml/min)。利用DNA和GAGs定量试剂盒检测各灌注流速亚组的DNA和GAGs残留量。9.统计学方法测量结果通过SPSS15.0软件包处理,实验数据均以平均数士标准差表示,采用one-way ANOVA判断各处理组与自然对照组有无差异,各处理组的差异性采用SNK检验,P<0.05具有统计学意义。实验结果：1.以0.25%SDS、0.5%SDS、0.75%SDS灌注的肝脏在灌注2h后大鼠肝脏均成功地去细胞,产生了全肝脏细胞支架,并呈现透明外观,包膜完整,保留了肝脏的形态,肉眼可见包膜内的Glisson系统保存。以1%Triton X-100、2%TritonX-100及3%Triton X-100灌注后的1.5h后肝脏基本呈现透明外观,但是仍然有一小片区域呈淡黄色,灌注持续2h后,淡黄色区域仍然没有明显消失。2.各处理组DNA残留量显示只有0.25%SDS组、0.5%SDS组及0.75%组的DNA量小于50ng/mg(干重)；另外,各处理组的残留DNA量仅为自然对照组DNA量2546.81±526.39 ng/mg(干重)的2%-4%。各处理组之间均未有明显统计学差异(P＞0.05)3.通过免疫荧光,可以展现细胞外基质中的五种蛋白成分在去细胞肝脏支架中的分布。在所有样本,可见Collagen-Ⅰ的阳性标记广泛存在于细胞外基质,主要位于肝小叶之间的纤维连接组织中。Collagen-Ⅳ则位于正常肝脏中内大管道,在以上6种去细胞方法处理组中可见Collagen-Ⅳ阳性标记存在于细胞外基质中一些保持着血管结构的区域。Fibronection在荧光图片中与Collagen-I阳性标记区位置大致相同；而elastin与lamininα-2的阳性标记可见于一些较大的管道周围。4. GAGs的含量在0.25%SDS处理组、1%Triton X-100处理组分别为4.054±0.77(μg/mg,干重)、4.25±0.54(μg/mg,干重)约为正常肝脏GAGs含量(8.16±0.28μg/mg,干重)的50%左右,这两个处理组之间无统计学差异(P>0.05),而GAGs的含量均大于其他组且有统计学差异(P<0.05)。5.电镜显示在去细胞化肝脏支架中可见包含着包膜和脉管结构的三维的细胞外基质微结构,通过电镜检测可见各组去细胞化肝脏支架的包膜是完整的,并且有可见一些管道系统的存在。但1%Triton X-100处理组、2%Triton X-100处理组及3%Triton X-100可见去细胞化肝脏支架内的胶原纤维排列较为松散,而0.25%SDS处理组、0.5%SDS处理组及0.75%SDS处理组内的胶原纤维排列较为紧凑。6.体外细胞毒性实验结果显示0.25%SDS处理组、0.5%SDS处理组、0.75%处理组、1%Triton X-100处理组与对照组在1天、3天、5天的OD值无明显统计学差异(P＞0.05);而2%Triton X-100处理组、3%Triton处理组在第3天、第5天OD值均其他处理有明显的降低,且具有明显统计学差异(P<0.05),并与第1天相比,这两组的OD值均降低。7.在3 ml/mim、5 ml/min、7 ml/m和10 ml/min灌注亚组所需要的0.25%SDS的量为500ml,600ml,600ml, and 600ml.3ml/min灌注组、5ml/min灌注组、7ml/min灌注组及10ml/min灌注组残留DNA量分别为49.15±5.98ng/mg、 46.14±6.08ng/mg、43.68±7.82ng/mg及62.14±5.82ng/mg,四个亚组均无统计学差异(P>0.05)。只有10ml/min灌注组DNA残留量>50ng/mg.3 ml/min灌注亚组的GAGs量为3.664±0.57μg/mg(干重),5 ml/min灌注亚组的GAGs量为4.05±0.77μg/mg(干重),7ml/min灌注亚组的GAGs量为4.82±0.47μg/mg(干重),and 10ml/min灌注亚组的GAGs量为5.18±0.54(干重)。7ml/min灌注亚组和10ml/min灌注亚组的GAGs含量均高于其他亚组,且统计学意义(P<0.05)。而7ml/min灌注亚组和10ml/min灌注亚组的GAGs含量无统计学差异(P>0.05).结论：①低浓度的SDS即0.25%不仅能够完整地去除大鼠肝脏内的细胞及细胞内核性物质,同时也能保留足够多的细胞外基质成分。②经SDS或1%Triton X-100处理后的大鼠去细胞支架未有细胞毒性物质的残留,能够支持细胞的生长③7ml/min灌注流速能够在最短时间内完成整个灌注去细胞过程,并保留足够多的细胞外基质成分。