益元康方中灵芝总多糖、总三萜提取纯化工艺研究

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目的:研究益元康方中灵芝中具有免疫调节作用的总多糖、总三萜,进行提取、筛选和分离纯化,优选最佳工艺参数,为进一步利用细胞模型进行体外免疫学研究打下基础。方法:(1)以灵芝中总三萜、灵芝酸A为考察指标,采用紫外-可见分光光度法建立灵芝总三萜的含量测定方法;采用HPLC法建立灵芝酸A含量测定方法(2)搜集不同产地、不同批号的灵芝,以灵芝酸A、灵芝酸G为对照品,灵芝酸A为参照物建立灵芝药材的指纹图谱并进行聚类分析;(3)通过正交实验研究总多糖的提取工艺及醇沉工艺,确定最佳工艺参数;通过单因素实验和均匀设计研究总三萜的提取工艺,确定总三萜提取最佳工艺参数;(4)通过对不同类型的大孔吸附树脂吸附、解吸性能的考察,优选出最佳树脂,并在单因素实验的基础上结合正交设计、均匀设计确定总多糖、总三萜纯化工艺参数。结果:(1)灵芝药材含量测定方法研究:建立灵芝总三萜、灵芝酸A含量测定方法。(2)灵芝药材指纹图谱研究:10批合格灵芝药材指纹图谱中,以灵芝酸A、灵芝酸G为对照品,共标定出31个共有峰,共有峰面积占总峰面积比值平均值为71.77%;聚类分析将10批灵芝药材共分为4类,不同产地灵芝有显著差异。(3)灵芝总多糖、总三萜提取工艺研究:灵芝总多糖的提取工艺为:12倍量水,提取3次,每次2h,提取率可达到83.87%;总多糖的醇沉工艺为:相对密度1.05,含醇量80%,醇沉24h,醇沉后粗粉中多糖含量达25.76%;总三萜提取工艺为:8倍量,90%乙醇,提取3次,每次100min,提取率达88.39%。(4)灵芝总多糖、总三萜纯化工艺研究:选择AB-8作为纯化灵芝总多糖的最佳树脂,优化的工艺参数为:上样液浓度2.0mg·ml-1,上样液PH=7,上样流速1.0ml·min-1,上样径高比为1:8,上样量2.0BV;洗脱剂为30%乙醇,洗脱用量3BV,洗脱液PH=8,洗脱流速1.0ml·min-1,纯化后总多糖的富集程度为47.21%,提高了23.95%;选择HPD-400作为纯化灵芝总三萜的最佳树脂,优化的工艺参数为:上样液浓度10.51mg·ml-1,上样液PH=3,上样流速1.0ml·min-1,上样径高比为1:7,上样量2.5BV;洗脱剂选择乙酸乙酯,洗脱流速1.0ml·min-1,用量3.4BV,纯化后总三萜的富集程度为54.84%。结论:通过对灵芝总多糖、总三萜提取纯化工艺的研究,其提取纯化工艺可行,制得总多糖、总三萜质量稳定可控。
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