苎麻纤维发育相关转录组测序及expansin家族功能分析

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苎麻(Boehmeria nivea L.Gaud)是荨麻科(Urticaceae)苎麻属(Boehmeria)的多年生宿根性草本开花植物。苎麻主要采用传统育种方法进行育种,由于种植面积大幅萎缩、科研人员不足以及研究基础薄弱等原因,其新品种的育种进程一直比较缓慢,需要尽快引入分子育种手段加快其育种进程。本研究对苎麻纤维发育进行了转录组测序和对expansin家族进行了基因克隆和功能分析,主要实验结果如下:1.进一步优化了苎麻不同样品总RNA提取技术,并使用该基于异硫氰酸胍作为主要裂解成分的提取技术,成功从苎麻不同部位茎皮材料分别提取得到高质量总RNA,以用于转录组测序。转录组测序分别使用黑杆前期苎麻不同部位茎皮材料代表韧皮纤维不同发育时期,连接不同接头之后使用罗氏454 FLX+平台进行混样转录组测序,共得到1030057个reads,平均读长457 bp。对测序结果进行拼接后,共得到58369条unigene,序列长度范围为90 bp到7641 bp,其中51025条(占87.42%)序列长度大于200 bp,8025条(占13.75%)序列长度大于1000 bp。最后,58369条unigene(13386条contig和44983条isotig)中有25071条unigene(7065条contig和18006条isotig)得到了有效的注释,共对应于6283条GO条目和3076条KO条目。通过对差异性表达基因、GO条目富集情况等分析表明茎皮上部样品在所有的样品中更为特殊,其所对应的苎麻纤维发育早期可能更容易受分子调控影响,从而影响苎麻纤维发育状况。在这之中,属于纤维素合酶基因家族的isotig0151477、isotig0691978、isotig0694325和isotig0715419,属于expansin基因家族的isotig1034523、isotig012516和isotig0205418,以及属于XTH基因家族的HRX1MBH01BLWDW9、isotig0061025、isotig0166322、isotig046608、isotig0977310和contig0490219在该样品相对于其余三个样品均为上调表达,表明这些基因可能参与苎麻茎皮上部样品中针对纤维发育的相关调控路径。2.使用同源序列克隆的方法,获得了五条苎麻expansin基因全长编码序列,并对表达量进行了初步研究。基于本实验室的三个转录组测序信息,克隆得到的expansin基因扩充至16个(12个属于α-亚族,分别命名为BnEXPA1-BnEXPA12;4个属于β-亚族,命名为BnEXPB1-BnEXPB4),共有22条(其中6个expansin基因在基因组中均有两个序列相异的克隆,分别命名为-1和-2)全长DNA序列(GenBank登录号:KY748166-KY748187)。序列分析表明,其外显子长度跨度较小(107 bp-485 bp)而内含子长度跨度较大(86 bp-1540 bp),cDNA全长分布为732 bp-831 bp,而DNA全长跨度为1040 bp-4259 bp。在随后对所克隆得到的expansin基因进行表达分析中,BnEXPA2、BnEXPA3、BnEXPA5和BnEXPA6在六个样品(茎尖、幼叶、成熟叶、茎皮上中下部)中的整体表达量和其它基因相比较高,BnEXPA12在这六个样品中表达量差异性最大,BnEXPA3、BnEXPA5、BnEXPA10和BnEXPB2在苎麻三季麻(头麻、二麻和三麻)不同时期(苗期、快速生长期、纤维成熟前期和后期)茎皮不同部位(苗期下部茎皮、快速生长期上部和下部茎皮、纤维成熟期上部、中部和下部茎皮)样品中的表达量和其它基因相比较高,BnEXPA11在上述所有样品以及三种胁迫处理(氯化钠、高温和低温胁迫)条件下表达量均极低。最后,BnEXPA1在不同胁迫条件下其表达量均显著上升,也是所有苎麻expansin基因中唯一一个在三种胁迫条件下相对表达量均显著上升的基因。与之相反,BnEXPA4、BnEXPA5、BnEXPA12、BnEXPB1和BnEXPB3在三种胁迫条件下其表达量均显著下降。这些在表达量研究过程中呈现一定表达规律的基因都可作为候选基因在后续实验中优先得到进一步的详细研究。综上,本项研究主要亮点如下:1.优化了苎麻RNA提取技术,并用于转录组测序中;2.转录组测序取样方法为苎麻中首创,与纤维发育状态对应;3.首次对苎麻茎皮样品进行转录组测序,研究纤维发育分子机理;4.使用同源序列克隆方法得到五条苎麻expansin基因序列;5.整合多个转录组测序结果进行苎麻expansin家族基因克隆;6.得到一批可能参与苎麻抗逆以及纤维发育相关通路的expansin基因。以上结果既对苎麻纤维发育分子机理进行了初步研究,也为后续苎麻基因工程以及相关领域研究提供了范式和平台数据。
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