【摘 要】
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目的镉（Cd）是一种有毒重金属,也是已知的生殖毒物。前期研究发现镉诱导睾丸精原细胞凋亡,其分子机制目前尚不清楚。本研究主要观察CdCl2对小鼠精原细胞线粒体Ca2+稳态的影响,基于IP3R-VDAC1-MCU信号通路探讨线粒体钙超载在镉诱导精原细胞凋亡中的作用。方法小鼠精原细胞（GC-1 spg cells）分为对照组、BAPTA组、Cd处理组、以及BAPTA+Cd保护组:Cd处理组细胞采用20μ
【基金项目】
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国家自然科学基金（31571557）；
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目的镉（Cd）是一种有毒重金属,也是已知的生殖毒物。前期研究发现镉诱导睾丸精原细胞凋亡,其分子机制目前尚不清楚。本研究主要观察CdCl2对小鼠精原细胞线粒体Ca2+稳态的影响,基于IP3R-VDAC1-MCU信号通路探讨线粒体钙超载在镉诱导精原细胞凋亡中的作用。方法小鼠精原细胞（GC-1 spg cells）分为对照组、BAPTA组、Cd处理组、以及BAPTA+Cd保护组:Cd处理组细胞采用20μM CdCl2处理24h。对照组细胞采用等体积PBS处理。BAPTA组细胞采用10μM BAPTA-AM进行孵育,BAPTA+Cd保护组细胞采用BAPTA-AM（10μM）预处理1h,然后再采用20μM CdCl2处理24h。于CdCl2处理24后,收集细胞,主要观察以下指标:采用Annexin V-FITC/PI法检测精原细胞凋亡。利用荧光探针DCFH-DA采用流式细胞仪检测细胞活性氧;以JC-1为荧光探针采用采用流式细胞仪检测线粒体膜电位;以Fluo-4 AM Ca2+作为探针检测细胞质钙离子[Ca2+]c,采用Rhod-2 AM Ca2+探针检测线粒体钙离子[Ca2+]mit,采用Mag-Fluo-4 AM作为探针检测内质网钙离子[Ca2+]ER。提取细胞m RNA,采用RT-PCR技术检测细胞VDAC1、MCU、MCUR1 m RNA的表达。制备细胞匀浆,采用western blot技术检测分别检测Cyt c、AIF、p-IP3R/IP3R、VDAC、MCU、MCUR1蛋白的表达。结果与对照组相比,Cd处理能够引起细胞内活性氧上升,线粒体膜电位下降,诱导细胞凋亡。此外,Cd处理组线粒体AIF和Cyt c蛋白表达降低,而胞质中AIF和Cyt c蛋白表达上升。进一步研究发现,CdCl2能够激活IP3R-VDAC1-MCU信号通路,导致精原细胞线粒体钙超载。BAPTA-AM明显抑制CdCl2诱导的IP3R磷酸化,几乎完全抑制CdCl2上调的VDAC、MCU和MCUR1的m RNA和蛋白质表达水平。此外,BAPTA-AM明显降低CdCl2引起的内质网钙离子浓度下降,拮抗CdCl2引起的线粒体与胞质钙离子浓度升高。BAPTA-AM能够抑制CdCl2诱导的精原细胞ROS的产生,增加线粒体膜电位,降低了CdCl2引起的精原细胞线粒体AIF、Cyt c的释放,明显降低CdCl2增加的精原细胞凋亡百分率。结论（1）CdCl2能够激活IP3R-VDAC1-MCU信号通路,导致精原细胞线粒体钙超载。（2）BAPTA-AM抑制CdCl2激活的IP3R-VDAC1-MCU信号通路,拮抗CdCl2引起的线粒体钙超载,保护镉诱导的小鼠精原细胞凋亡。（3）CdCl2可能通过IP3R-VDAC1-MCU信号通路引起线粒体钙超载诱导精原细胞凋亡。
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