目的：肺癌是世界癌症相关死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌(Non-small celllung cancer, NSCLC)占原发肺癌的80％-85％。大多数NSCLC患者初诊时已属中晚期。NSCLC的不良预后很大程度上归咎于其较高的远处转移率。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞获得间质细胞特性，使其细胞间黏附力减低，细胞迁移、侵袭力增强的一种可逆的表型转化过程，在肿瘤侵袭、转移、耐药方面发挥重要作用。因此，探究调控非小细胞肺癌EMT的分子机制，逆转EMT过程，对改善患者预后有重大意义。骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种分泌性糖蛋白，可由肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞产生，在肿瘤形成、侵袭、转移等方面发挥重要作用。既往研究发现:OPN在人类多种恶性肿瘤中高表达，如乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌等，包括非小细胞肺癌。此外，在非小细胞肺癌，肝细胞癌，胃癌等多种恶性肿瘤中，肿瘤组织OPN表达水平的升高与肿瘤患者的不良预后密切相关。近期研究显示，OPN可诱导乳腺癌、肝癌细胞EMT,但其诱导NSCLC细胞EMT的分子机制尚未明确。探究OPN诱导NSCLC细胞EMT的分子机制，对于找到OPN高表达的患者的潜在特异性治疗靶点有重要意义。SIRT1是一种去乙酰化酶，研究表明多种细胞因子，如TGF-β，TNF-α，IL-1β均可通过调节SIRT1的表达，调控多种病理生理过程，而OPN是否会对SIRT1表达产生影响尚不明确。SIRT1参与调控与肿瘤进展相关的多条信号通路。然而，文献显示SIRT1在肿瘤EMT中的作用具有两面性，一方面在乳腺癌、口腔鳞癌中SIRT1抑制肿瘤细胞EMT;另一方面，在前列腺癌中，SIRT1又可促进EMT。SIRT1在EMT中的作用与其所属的肿瘤微环境及下游作用靶点密切相关。OPN作为肿瘤微环境中的重要蛋白，其与SIRT1的关系在肿瘤中尚无相关文献报道。本研究旨在探讨OPN对SIRT1表达的影响及在高水平OPN条件下，SIRT1对OPN诱导的NSCLC细胞EMT的影响，并进一步探讨这一作用可能的信号传导机制。　　方法：⑴实时荧光定量PCR（简称定量PCR）和ELISA测定4种人NSCLC细胞株和人正常肺上皮细胞株中OPN的mRNA表达和蛋白分泌水平。选择基础OPN分泌水平较低的两种NSCLC细胞株用于后续实验。⑵不同浓度(0-400 ng/ml)的OPN处理NSCLC细胞24 h，定量PCR和Western blot测定SIRT1和E-钙粘蛋白的mRNA和蛋白表达水平，Western blot测定乙酰化NF-κB(核因子-κB)p65和总NF-κB p65的蛋白表达水平。⑶应用SIRT1过表达慢病毒载体（LV-SIRT1）构建过表达SIRT1的A549和NCI-H358非小细胞肺癌细胞株，同时设立感染阴性对照病毒载体(LV-NC)的细胞进行对照。定量PCR和Western blot测定感染后96 h的SIRT1表达情况。⑷将感染LV-SIRT1和LV-NC的A549和NCI-H358细胞分别应用400 ng/ml OPN或等量对照溶剂（Control buffer, CB）处理，观察细胞形态。⑸将感染LV-SIRT1和LV-NC的A549和NCI-H358细胞分别应用400 ng/ml OPN或等量CB处理，24 h后应用定量PCR和Western blot测定EMT相关标记物的表达水平。Western blot测定乙酰化NF-κB p65和总NF-κB p65的蛋白表达水平。⑹将感染LV-SIRT1和LV-NC的A549和NCI-H358细胞分别应用不同浓度(0-400 ng/ml) OPN处理24 h，CCK-8测定细胞增殖能力;将感染后的细胞应用400 ng/ml OPN或等量CB处理0，12，24，48 h，CCK-8再次测定细胞增殖能力。⑺将感染LV-SIRT1和LV-NC的A549和NCI-H358细胞分别应用400 ng/mlOPN或等量CB处理48 h，划痕实验测定细胞迁移能力，Transwell侵袭实验测定细胞侵袭能力。⑻将感染LV-SIRT1或LV-NC的A549和NCI-H358细胞分别应用400 ng/mlOPN处理2h，分别提取细胞核、细胞浆和细胞总蛋白，Western blot分别测定细胞核和细胞浆中NF-κB p65的表达水平，并测定细胞总蛋白中IκB-a和IKK-a的表达水平。免疫荧光技术检测NF-κB p65的表达水平及分布情况。⑼应用NF-κB抑制剂PDTC预处理细胞30min，再加入400ng/mlOPN处理24h，定量PCR和Western blot测定EMT相关标记物的表达水平。　　结果：①定量PCR结果显示NSCLC细胞OPN mRNA表达水平明显高于正常肺上皮细胞，ELISA结果显示NSCLC细胞OPN蛋白分泌水平明显高于正常肺上皮细胞。选择基础OPN分泌水平较低的A549和NCI-H358非小细胞肺癌细胞用于后续OPN处理实验。②定量PCR结果显示OPN可明显抑制A549和NCI-H358细胞SIRT1 mRNA的表达水平，同时明显抑制E-钙粘蛋白mRNA的表达水平(P＜0.05)。在蛋白水平上，Western blot分析显示OPN可明显抑制细胞SIRT1和E-钙粘蛋白的表达水平(P＜0.05)，除此之外，OPN明显提高了细胞acetyl NF-κB p65的表达水平(P＜0.05)，且不改变总NF-κB p65的表达水平。③定量PCR和Western blot结果均显示感染LV-SIRT1的A549和NCI-H358细胞SIRT1表达水平明显高于感染LV-NC的细胞(P＜0.05)。SIRT1表达水平在感染LV-NC的细胞和空白对照细胞中的差别无统计学意义。④400 ng/ml OPN处理慢病毒感染后的A549和NCI-H358细胞，72 h后观察细胞形态发现:经OPN处理的感染LV-NC的细胞呈现类似间质成纤维细胞的梭形。然而，经OPN处理的SIRT1过表达细胞与未加OPN处理的细胞相似，依然保持着上皮细胞的鹅卵石样形态。⑤400 ng/ml OPN处理慢病毒感染后的A549和NCI-H358细胞，24h后定量PCR和Western blot分别测定EMT相关标记物的表达水平。结果显示SIRT1过表达可明显抑制OPN诱导的上皮标记物(E-钙粘蛋白)mRNA和蛋白的表达水平下调，同时抑制OPN诱导的间质标记物(N-钙粘蛋白和波形蛋白)表达水平上调(P＜0.05)。同时，Western blot显示单纯SIRT1过表达细胞的acetyl NF-κB p65表达水平明显低于空白对照组(P＜0.05)。OPN可明显上调acetyl NF-κB p65的表达水平，而SIRT1过表达可明显抑制OPN诱导的NF-κB p65乙酰化(P＜0.05)。⑥CCK-8实验显示OPN可促进NSCLC增殖，而SIRT1过表达可明显抑制OPN诱导的细胞增殖(P＜0.05)。⑦400 ng/ml OPN处理慢病毒感染后的细胞48 h，划痕实验和Transwell侵袭实验结果显示:SIRT1过表达可明显抑制OPN诱导的A549和NCI-H358细胞迁移和侵袭(P＜0.05)。⑧400 ng/ml OPN处理慢病毒感染后的A549和NCI-H358细胞2h，Western blot显示OPN可明显提高细胞核中NF-κB p65表达，同时降低细胞浆中NF-κB p65表达，SIRT1过表达可明显抑制OPN诱导的NF-κB p65核转位（P＜0.05）。细胞免疫荧光的方法也得到了相同的结论。同时，Western blot显示OPN可降低细胞IκB-a表达水平，提高IKK-a表达水平，SIRT1过表达可明显抑制OPN诱导的IκB-a表达下调以及IKK-a上调(P＜0.05)。⑨NF-κB抑制剂PDTC可明显抑制OPN诱导的E-钙粘蛋白下调和N-钙粘蛋白上调(P＜0.05)。　　结论：⑴OPN明显抑制NSCLC细胞的SIRT1表达水平，促进NF-κB p65乙酰化。⑵OPN通过抑制SIRT1表达诱导NSCLC细胞上皮间质转化。⑶SIRT1过表达明显抑制OPN诱导的NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭。⑷SIRT1过表达通过抑制OPN诱导的NF-κB通路激活，进而抑制OPN诱导的NSCLC细胞上皮间质转化。