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传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)能引起鸡群以免疫抑制为特征的急性接触性传染病，除直接损失外，还由于该病毒造成鸡群对其它病原的易感性增强和免疫失败，往往带来巨大的间接损失。自上世纪80年代开始出现IBDV变异株和超强毒株以不，传统的灭活苗和弱毒苗防治方法已面临严峻的考验。我国养禽业规模日益扩大，而IBDV流行情况复杂，具有自主知识产权的IBDV疫苗又少，因此迫切需要解决这一矛盾。用杆状病毒-家蚕表达系统表达IBDV病毒蛋白旨在(1)深入了解家蚕作为生物反应器表达IBDV蛋白的能力，从而将我国尤其是江浙地区的优势产业与不断发展的分子生物学技术结合起来，在降低IBDV疫苗生产成本的同推动蚕桑业的多元化发展；(2)比较用该系统表达的IBDVVP2蛋白和多聚蛋白的免疫原性，为开发高效广谱的IBDV基因工程疫苗打下基础。 以本实验组已克隆的IBDV JD1株(细胞弱化株)基因组A节段为模板，用PCR分别扩增出多聚蛋白(VP2／4／3)的cDNA和VP2蛋白的cDNA，将两者分别克隆入基于家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的转移载体pBacPAK-8的多角体蛋白启动子下游，重组载体与人工突变型杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕培养细胞(BmN)后，经过数轮挑斑纯化和扩增，获得不含亲代病毒Bm-BacPAK6的重组杆状病毒(rBV)BacPAK-A和BacPAK-VP2。重组杆状病毒感染BmN细胞至其出现细胞病变后，提取细胞总DNA，用DIG标记的IBDV特异性探针作点杂交可检测到阳性杂交信号；提取经过BmN细胞连续传代15次的重组杆状病毒BacPAK-A的感染细胞总DNA作PCR和Southern分析，均出现了特异性条带，说明IBDV多聚蛋白基因和VP2基因己通过同源重组插入杆状病毒Bm-BacPAK6的基因组中，且BacPAK-A至少在体外传代15次以内是稳定的。重组杆状病毒通过血淋巴腔注射的方式感染5龄起家蚕幼虫进行蚕体内表达，从感染后3天家蚕有明显发病症状开始每天随机取蚕血淋巴冻存备用，到感染后6天，大部分家蚕已至濒死状态。用ELISA、SDS PAGE和Western blotting等方法检测收集的家蚕血淋巴，结果表明IBDV多聚蛋白基因和VP2基因在蚕体内得到表达，表达产物具有免疫反应性，表达量在感染后5-6天达最高水平。 用感染后第5天的家蚕血淋巴作抗原制各矿物油乳剂苗，进行了该疫苗的安全性试验和浙江大学博士学位论文:在家蚕中表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白及其免疫原性的研究摘要免疫一攻毒试验。在安全性试验中，以皮下注射途径接种1倍和5倍免疫剂量的14日龄雏鸡均未出现临床反应，扑杀后亦未见剖检变化。在免疫一攻毒试验中对非免疫雏鸡进行14日龄首免和28日龄加强免疫，同时设IBDv商品疫苗D78作为免疫效果对照，免疫后定期采血作抗体检测。加强免疫25天后用IBDV强毒(B C6/85株)攻击，攻毒后第5天扑杀并剖检，眼观病变、囊体比值、组织切片病理学观察和血清学试验表明，重组IBDV多聚蛋白疫苗与重组IBDV VPZ蛋白疫苗相比，能更有效地抵抗IBDV强毒(BC6/85株)的攻击，对试验鸡的临床保护率(80%/73%)和病理保护率(80%/53%)均高于后者，其诱导的IBDV中和抗体水平亦明显高于后者(GMT 9769/4088);多聚蛋白疫苗与商品化疫苗D78相比，诱导IBDV中和抗体升至最高水平的速度较慢(加强免疫后25天/18天)，但后者诱导抗体的持续时间短，且造成的法氏囊病变比多聚蛋白严重(法氏囊病变等级:2十十+/1十，2十十)。因此我们认为，IBDV多聚蛋白是比VPZ蛋白更适于作为免疫原的病毒成分。 在完成全部实验室试验的基础上，向农业部递交了农业转基因生物中间试验报告书(项目名称:用蚕表达的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)新型疫苗在浙江省的中间试验)，得到批复后，用含重组IBDV多聚蛋白的家蚕血淋巴制备矿物油佐剂疫苗，在浙江省桐庐县一生态禽养殖场对300羽非免疫雏鸡进行9日龄首免和23日龄加强免疫，免疫后鸡群生长良好，未发现任何不良反应，也无IBD的发生;血清ELISA试验表明免疫后有高滴度IBDV抗体的产生。与此同时，按农业部要求进行了重组杆状病毒的遗传稳定性检测和含重组多聚蛋白的家蚕血淋巴的急性毒性试验，结果表明，重组杆状病毒至少在100次体外传代中是稳定的;作为疫苗抗原成分的家蚕血淋巴对小鼠无急性毒性。 本研究首次利用杆状病毒一家蚕生物反应器表达了IBDV多聚蛋白，并对同一系统表达的IBDV VPZ蛋白进行了免疫效果的比较。虽然研究表明在该系统中VPZ的表达量明显高于多聚蛋白的表达量，但在相同免疫剂量的前提下，多聚蛋白的免疫原性则显著强于相同P加值的VPZ。结果表明，用含IBDV多聚蛋白的蚕血淋巴制备的疫苗安全、有良好的免疫原性，为用家蚕生物反应器开发IBDV新型疫苗奠定了基础。进一步的研究重点是(1)优化表达条件，进一步提高多聚蛋白的表达量;(2)进行多基因的联合/融合表达，以增强多聚蛋白的免疫原性和拓宽疫苗的保护谱