目的:肺癌是发病率和死亡率都很高的肿瘤,中国每年新诊断肺癌人数占全球三分之一。放射治疗单独或联合使用是肺癌患者常采用的治疗方法,但放射抗拒是常规放疗难以进一步提高疗效的因素之一。碳离子放射治疗以其特有的物理和生物学特性,在临床放疗中比常规光子放疗更具有优越性。但是碳离子治疗的确切放射生物学机制尚未完全阐明。所以研究肺癌细胞碳离子和X线辐射后有差异变化的效应分子,可能对于开发碳离子诱导的效应生物大分子的临床应用具有潜在价值。方法:1.重离子辐射敏感性研究主要采用鳞癌细胞株和黑色素瘤细胞株。辐射类型为X射线和碳离子束,分不同剂量照射组。通过克隆形成法测定X射线和碳离子照射后细胞的存活率,绘制存活曲线,计算LD50来评估细胞辐射敏感性。2.辐射后LNC RNA表达谱的筛选采用4Gy X射线和碳离子辐射后提取总RNA行LNC RNA芯片检测,并行荧光定量PCR验证。3.LNC CRYBG3和肺癌关系研究通过荧光定量PCR的方法,测定LNC CRYBG3的表达在肺癌样本和肺癌细胞株中的表达与正常组织或细胞对比是否存在差异。4.LNC RNA细胞效应研究部分采用克隆形成法、流式细胞术等测定细胞的周期变化、增殖和凋亡;并通过活细胞工作站研究细胞分裂过程。细胞增殖、周期和凋亡分别采用过表达LNC CRYBG3和干扰LNC CRYBG3的细胞株为模型开展实验。lncRNA的过表达采用腺病毒过表达载体感染肺癌细胞。lncRNA的干扰表达采用过表达shRNA载体的慢病毒感染肺癌细胞,构建稳定表达系。5.LNC CRYBG3作用机制研究部分使用到的方法如下:采用免疫荧光技术,研究其对细胞骨架微丝的影响;进行目标RNA的RNA Pull-down实验,明确与LNC CRYBG3相互作用的靶蛋白,行Western Blot实验验证拉下的蛋白。通过RNA免疫共沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP)实验验证Actin可以吸附LNC CRYBG3。6.动物实验部分,通过构建LNC CRYBG3过表达和干扰表达的细胞株,构建小鼠的移殖瘤模型和体内转移模型,观测成瘤情况。构建荷瘤小鼠后,通过注射LNC CRYBG3腺病毒过表达载体或LNC CRYBG3干扰表达载体,研究LNC CRYBG3对肿瘤生长的影响。通过FISH检测小鼠瘤体内的LNC CRYBG3表达、Actin聚合等情况;使用免疫组化技术检测肿瘤分化。肺癌细胞转移模型是将构建好的细胞株通过小鼠的尾静脉注射,用小动物活体成像仪观察肺癌细胞在小鼠肺部的归巢和增殖状况,评估各个细胞株的转移情况。结果:1.癌细胞的重离子辐射敏感性研究:鳞状细胞癌对X射线敏感而黑色素瘤细胞对X射线抵抗;但碳离子束对黑色素瘤细胞和鳞状细胞癌都有较强的杀灭能力;碳离子对鳞癌细胞的杀伤作用强于X射线。2.辐射相关lncRNA表达谱研究:芯片数据证明X射线辐射和碳离子辐射均能引起广泛的长链非编码RNA的表达变化。这些变化与细胞骨架动力学调控、细胞周期调控、细胞有丝分裂调控、细胞凋亡调控等密切相关。其中LNC CRYBG3在X射线和碳离子照射后均上调表达,碳离子辐射后LNC CRYBG3的表达量显著高于X射线照射组。结果提示LNC CRYBG3可能与碳离子辐射敏感性相关。3.LNC CRYBG3表达量与临床肺癌组织和正常组织的关系:正常肺组织中LNC CRYBG3表达明显低于肺癌组织。淋巴结转移患者肺癌组织中LNC CRYBG3的表达显著高于无淋巴结转移患者肺癌组织。结果表明,LNC CRYBG3与肺癌的恶性程度呈正相关。4.LNC CRYBG3对细胞周期、增殖和凋亡的影响:过表达LNC CRYBG3能显著引起细胞周期的G2/M期阻滞。进一步通过磷酸化H3的染色发现,细胞主要出现了 M期阻滞。LNC CRYBG3过表达后细胞出现大量的双核细胞。细胞出现M期阻滞引起了细胞增殖速度显著降低和细胞凋亡。5.LNC CRYBG3对细胞骨架动力学的影响:免疫荧光实验发现LNC CRYBG3过表达能导致细胞骨架的微丝解聚,对微管结构影响不明显。RNA Pull Down和RIP实验及体外无细胞系统内聚合实验证明LNC CRYBG3可以直接和Actin相互作用。LNC CRYBG3和Actin结合后,抑制球状肌动蛋白G-actin聚合成丝状肌动蛋白F-actin,破坏微丝结构。微丝结构的破坏还导致了细胞有丝分裂末期缢束环结构的形成失败。LNC CRYBG3的截短体和突变体设计,显示LNC CRYBG3的空间结构与其功能相关。随后通过Actin S14C突变体构建,发现肌动蛋白的14位丝氨酸可能是影响肌动蛋白与LNC CRYBG3结合或发挥作用的重要位点之一。6.LNC CRYBG3对小鼠肺癌移植瘤的影响:LNC CRYBG3能够显著抑制小鼠移殖瘤的生长。过表达LNC CRYBG3的细胞形成的移殖瘤的体积和质量显著降低。干扰LNC CRYBG3的细胞形成的移殖瘤体积显著增大,这个现象说明过表达LNC CRYBG3能够抑制肿瘤的增殖。但干扰LNC CRYBG3后肿瘤分化程度增高,过表达LNC CRYBG3后肿瘤分化程度变低。肿瘤细胞转移实验发现过表达LNCCRYBG3能抑制肺癌细胞的体内转移。结论:本研究以碳离子辐射、肺癌细胞和肺癌组织为研究对象,研究LNC CRYBG3通过与Actin互作对肺癌影响。得到结论如下:1.电离辐射,包括X射线辐射、碳离子辐射均能导致LNC CRYBG3的表达量升高。而碳离子较X射线辐射LNC CRYBG3表达升高更显著。2.高表达的LNC CRYBG3可导致细胞周期M期阻滞和细胞凋亡,这提示LNC CRYBG3的表达变化可能是碳离子等辐射导致细胞凋亡的机制之一,并可能与细胞对碳离子辐射敏感性更高的机制相关。3.LNC CRYBG3可抑制小鼠非小细胞肺癌移殖瘤的增殖和肺癌细胞的体内转移,这也可能与LNC CRYBG3可导致细胞M期阻滞和细胞凋亡有关。4.LNC CRYBG3能够抑制G-actin聚合成F-Actin,致细胞骨架破坏,并导致有丝分裂末期缢束环结构不能正常装配,无法完成细胞质分裂,这可能是细胞最终凋亡的原因之一。5.LNC CRYBG3抑制G-actin的聚合是通过其与G-Actin直接结合引起的。F-Actin不能形成,致细胞骨架坍塌,并出现双核细胞,细胞异型性增加。这提示LNC CRYBG3可能通过抑制细胞骨架的结构影响肺癌发生的过程。6.在肺癌细胞和肺癌组织中LNC CRYBG3表达均增高。干扰LNC CRYBG3后肿瘤分化程度增高。过表达LNC CRYBG3后肿瘤分化程度变低,提示LNC CRYBG3对肺癌的恶性分化可能有促进作用。这个结果有待进一步研究,以探讨LNCCRYBG3在肺癌的发生阶段和进展阶段所起的作用是否并不相同。7.LNC CRYBG3或许可以作为研究肺癌发生、进展和治疗的一个新的切入点。