【摘 要】
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肾型传染性支气管炎病毒（NIBV）感染是目前生产上引起鸡痛风发生的常见病因之一。而本研究旨在探讨内质网应激和细胞凋亡在NIBV致痛风鸡肾脏损伤的相关性,意在阐明内质网应激和细胞凋亡在NIBV致痛风鸡肾脏损伤的调控作用及机制。本试验选取300羽海兰褐雏鸡随机分成对照组和攻毒组,在28日龄攻毒组滴眼接种NIBV毒株SX9(10-5/0.2 m L),对照组每羽滴眼0.2 m L无菌生理盐水,试验周期为
【基金项目】
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国家自然科学基金（32072935和31860723）; 江西现代农业家禽产业技术体系项目（JXARS）
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肾型传染性支气管炎病毒（NIBV）感染是目前生产上引起鸡痛风发生的常见病因之一。而本研究旨在探讨内质网应激和细胞凋亡在NIBV致痛风鸡肾脏损伤的相关性,意在阐明内质网应激和细胞凋亡在NIBV致痛风鸡肾脏损伤的调控作用及机制。本试验选取300羽海兰褐雏鸡随机分成对照组和攻毒组,在28日龄攻毒组滴眼接种NIBV毒株SX9(10-5/0.2 m L),对照组每羽滴眼0.2 m L无菌生理盐水,试验周期为28天。于攻毒后第1天、5天、11天、18天、28天,采集血液用于检测血清中尿酸和肌酐的含量;采集肾脏,制作病理组织切片,观察肾脏病变;使用免疫组化和免疫荧光技术分别检测内源性ATF-6和Bcl-2的表达变化;TUNEL法检测雏鸡肾脏凋亡水平。在定量检测肾脏各时间点的病毒载量后,利用RT-q PCR检测雏鸡肾脏未折叠蛋白反应通路关键基因（IP3R,GRP78,PERK,e IF2α,ATF-4,ATF-6,IRE1,XBP-1,CHOP）和细胞凋亡关键基因（Bax,Bcl-2,Caspase-3,Caspase-9,P53）m RNA转录水平以及通过蛋白免疫印迹法检测肾脏蛋白（GRP78,PERK,e IF2α,ATF-4,IRE1,Bax,Caspase-3,Bcl-2）表达水平,结果如下:1.肾型传支病毒感染可引起尿酸盐沉积,肾脏组织中并引起典型的“花斑肾”症状。另外,攻毒组肾组织结构肾小管管腔外有血细胞和炎症细胞浸润,并伴有严重的肾小球出血。2.与对照组相比,攻毒组血清尿酸在第11 dpi发生极显著上升（P＜0.01）,随时间的推移逐渐下降。肌酐含量在第11 dpi,18 dpi和28 dpi极显著升高（P＜0.01）,其他时间点无显著差异。3.透射电镜观察NIBV感染肾脏组织内质网形态发生变化,结果显示NIBV感染导致肾脏组织细胞内质网发生断裂,初步说明NIBV可诱导内质网应激。雏鸡在感染NIBV后,葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated p rotein,GRP78）m RNA表达在18 dpi极显著上升（P＜0.01）。蛋白免疫印迹结果显示,NIBV感染上调了GRR78蛋白的表达,进一步证实了NIBV感染诱导了鸡肾脏内质网应激。4.未折叠蛋白反应（Unfold protein response,UPR）通路分析,NIBV感染提高了PERK和e IF2α的m RNA水平和蛋白水平的表达（P＜0.01）。此外,结果显示NIBV感染能够提高下游基因ATF-4,CHOP的表达（P＜0.01或P＜0.05）。说明了NIBV病毒感染可激活PERK-e IF2α信号轴介导的UPR。RT-q PCR及蛋白免疫印迹结果表明,NIBV感染上调了p-IRE1α,XBP-1,ATF-6的表达（P＜0.01或P＜0.05）,说明NIBV感染诱导了IRE1底物XBP-1发生剪切和促进了ATF-6的表达。5.与对照组相比,透射电镜观察发现NIBV感染后鸡肾脏中出现了凋亡小体。RT-q PCR表明,NIBV感染上调了凋亡标志性基因Bax,Caspase-3,Caspase-9,P53的表达（P＜0.01或P＜0.05）,下调了Bcl-2的表达。蛋白结果显示,NIBV感染提高了Bax翻译水平和Caspase-3的剪切（P＜0.01或P＜0.05）和降低Bcl-2蛋白水平（P＜0.05）。此外,TUNEL染色结果证实NIBV感染引起凋亡细胞增多,进一步证明了细胞凋亡的发生。综上所述,NIBV感染诱发了鸡肾脏内质网的断裂,引起了内质网应激,激活了未折叠蛋白反应,整个过程促进肾脏细胞凋亡的发生,并且最终导致了肾脏损伤。
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