脂肪酶/酯酶作为一类重要的工业用酶在众多领域有着广泛应用。自然界中许多动物、植物、微生物均产脂肪酶/酯酶。目前，商品化的脂肪酶/酯酶主要来自于微生物。然而，现有商品化脂肪酶/酯酶数量少、价格贵，且多数在热稳定性及酸、碱、有机溶剂耐受性等方面表现不佳，因而促使人们不断地开发更多具有不同特性的新型脂肪酶/酯酶以适应各种工业应用需求。本论文拟以极端微生物和宏基因组为研究对象，利用基因组和宏基因组挖掘技术挖掘耐热脂肪酶/酯酶资源，以期获得具有优良特性和工业应用前景的脂肪酶/酯酶。主要研究工作和结果摘要如下：　　1.利用基因组挖掘技术获取了极端耐辐射球菌Deinococcus radiodurans四种脂肪酶（DR0334、DR1485、DR2078和DR2522）基因信息，并通过异源表达和纯化获得了四种纯度较高的重组脂肪酶。酶学性质研究表明：DR0334、DR1485、DR2078和DR2522均对短链对硝基苯酚酯表现出偏好性，其最适pH均为8.5，最适反应温度分别为40 oC,50 oC,60 oC和60 oC。DR0334于60 oC处理1 h后几乎完全丧失活性，而其他三种重组酶在80 oC处理6 h后还能保持70％以上的残余酶活，且对有机溶剂也表现出中等程度的耐受性。进化树分析显示：DR1485和DR2078分别属于脂肪酶第IV家族和第IX家族成员，而DR0334和DR2522则分别代表了新的脂肪酶家族。　　2.利用宏基因组技术构建了造纸厂活性污泥宏基因组文库，并利用三丁酸甘油酯平板筛选获得一酯酶基因est-XG2（NCBI登录号：KC904273），并对其进行了异源表达、性质研究、分类鉴定和结构模拟。该基因含有1506 bp，编码蛋白含501个氨基酸残基。序列比对显示，Est-XG2与来自Thermaerobacter marianensis DSM12885的酯酶（NCBI登录号：YP_004101478）具有最大相似性（identity:47%）。酶学性质测定表明：Est-XG2具有水解中短链对硝基苯酚酯的能力，其最适底物对硝基苯酚乙酸酯的Km和kcat值分别为0.33 mM和36.21 s-1，最适pH为8.5，最适温度为70 oC。热稳定性研究表明Est-XG2具有较强热稳定性，且其对有机溶剂表现出较强耐受性。Est-XG2的催化三联体由Ser192、Glu313和His412三个氨基酸残基组成，并通过定点突变进行了验证。进化树分析显示Est-XG2属于脂肪酶第VII家族成员。此外，Est-XG2还具有水解芳樟醇酯的能力。上述特性表明Est-XG2具有一定的工业应用价值。　　3．利用基因组挖掘技术从嗜热古菌Pyrobaculum sp.1860中获得了一酯酶基因（Uniprot:G7VG08，P186_1588），通过异源表达与纯化获得了纯度较高的重组酯酶（rP186_1588）并对其进行了Western-blot和质谱鉴定。性质研究表明：rP186_1588只能水解中短链（C2-C10）对硝基苯酚酯，最适底物为对硝基苯酚乙酸酯（Km为0.35 mM，kcat为11.65 s-1），最适pH为9.0，最适温度为80 oC。热稳定性测定表明，rP186_1588在90 oC条件下处理6 h后仍能保持70%左右的残余酶活，且圆二色谱分析进一步证明了其具有很强的热稳定性。此外，rP186_1588能够被丙酮和甲醇激活。rP186_1588的热稳定性和有机溶剂耐受性提示其具有一定的应用潜力。　　4．利用同源建模方法获得了质量较高的上述古菌酯酶P186_1588三级结构，其三级结构具有典型的α/β水解酶特征，由6个α-螺旋和7个β-折叠组成，其中α-螺旋位于β-折叠两侧，之间由多个loop结构连接而成。不同温度（300 K、353 K、373 K和473 K）条件下的分子动力学模拟揭示，P186_1588的热稳定性与其结构中大部分区域的刚性特征有关，其柔性区域主要分布在64-66和144-155位残基之间。此外，P186_1588中的四对盐桥（Arg14-Asp35、Arg114-Asp90、Lys178-Asp169和Arg168-Glu145）对维持其热稳定性发挥了重要作用。P186_1588和不同对硝基苯酚酯底物复合物的结合自由能分解显示 P186_1588与对硝基苯酚乙酸酯的结合自由能最小（-39.54 kcal/mol），范德华能为P186_1588与对硝基苯酚酯的结合过程提供了主要动力。上述数据在一定程度上解释了 P186_1588的热稳定性机制和底物选择性机制，为其后续的分子改造奠定了基础。