基于HPPRRSV N蛋白的快速免疫检测方法的建立与应用

来源 :河北师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhanghai_007
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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV),最早出现于欧洲,并于90年代初期在美国首次发现,从此,PRRSV就成为世界养猪业中的一大难题。PRRSV能引起猪的繁殖障碍以及其他疾病例如呼吸问题、体重减少和成长问题。本研究通过复苏实验室构建的重组菌株BL21(DE3)(pET-N),经限制性内切酶EcoRI、BamHI双酶切鉴定可用后,在先前优化好的条件下诱导重组菌株BL21(DE3)(pET-N)6小时,大量且稳定的表达HPPRRSV中的核衣壳(N)蛋白;随后对核衣壳蛋白进行镍柱纯化,以及Western blot实验检测,结果证明:该质粒上确实拥有ORF7基因,并且该基因插入至正确位置,pET-N质粒正确。纯化后的重组核衣壳蛋白的纯度大于90%;Westernblot结果显示:17kD处出现明显的反应条带,这表示重组的核衣壳蛋白具有良好的特异性和免疫原性。通过对间接ELISA实验中的抗原包被浓度、包被时间、封闭时间、封闭试剂、血清作用稀释倍数、二抗作用时间与稀释倍数等条件的优化,建立间接ELISA实验方法,并确定该方法的临界值、特异性、敏感性、变异系数及保质期。结果证明,建立的间接ELISA方法可以用于检测猪血清中抗N蛋白的抗体,且无明显交叉反应。利用N蛋白对小鼠进行免疫,当小鼠血清效价达到50000以上之后,进行细胞融合实验,使用间接ELISA方法筛选出9株针对N蛋白的细胞株和2株针对组氨酸标签的细胞株。采用辛酸硫酸铵方法纯化抗体后鉴定抗体亚型均为IgG型;抗体可以与PRRSV商品化试剂盒中的PRRSV抗原结合并得到阳性结果,与其他常见病毒无交叉反应。说明所得9株抗体的特异性很好。在得到质量良好的胶体金溶液后,优化了金标抗体的最适pH和最适标记量、兔抗PRRSV N蛋白抗体、兔抗鼠IgG的最佳包被量,并按筛选的用量在玻璃纤维素膜进行喷金,作为金标垫,在硝酸纤维素膜上分别包被兔抗PRRSV N蛋白抗体、兔抗鼠IgG作为检测线(T)和质控线(C)。按照文献的方法组装胶体金试纸条,检测其敏感性和特异性,为PRRSV的快速检测奠定基础。
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