EMP3对恶性黑色素瘤生物学行为的影响和机制研究

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恶性黑色素瘤(简称恶黑)是一种黑素细胞来源的侵袭性恶性肿瘤,其发病率逐年增高,发病年龄趋于年轻化,易转移,预后差;此外,其发病原因多种且复杂,危险因素有色素痣、太阳暴晒史、免疫抑制剂使用史、家族病史等。手术切除肿瘤及周围健康组织是治疗局部黑色素瘤的主要方法。然而,对于转移性恶黑,仍需靶向治疗、化疗、免疫疗法等策略进行治疗。但由于耐药或免疫耐受治疗效果欠佳,因而迫切需要开发分子生物标志物,来识别具有高风险原发病变的黑色素瘤患者,以更好的监测和辅助治疗。上皮膜蛋白3(epithelial membrane protein 3,EMP3)在机体器官及组织中广泛表达,其与乳腺癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌等多种癌症的发生与发展具有密切关系。早期的研究表明EMP3具有肿瘤抑制功能,近年来,研究者发现EMP3亦具有肿瘤促进功能。EMP3受DNA甲基化、micro RNA等影响在多种癌症中存在异常表达,通过调控肿瘤细胞内TGF-β/Smad、MAPK/ERK等信号通路,不仅影响肿瘤细胞的增殖、周期进程、迁移侵袭等生物学行为,而且影响其对化疗药物的耐受及免疫调节能力。但是,EMP3对恶性黑色素瘤生物学行为的影响尚未研究,其调控恶性黑色素瘤发生发展的作用机制尚无报道。肿瘤是机体的细胞异常增殖形成的新生物,其重要特征包括持续的增殖信号和过度的细胞分裂。细胞周期受多种信号通路的调节影响,而G1/S细胞周期检查点作为细胞周期调控的重要机制,其控制着真核细胞能否通过G1期进入DNA合成S期。已有研究表明,EMP3对肿瘤的细胞周期进程影响显著;其中,在肝癌细胞中,EMP3表达下调增强了p21和p27的表达水平,同时降低了cyclin E和cyclin D1的表达水平,从而引起肿瘤细胞G1期阻滞、抑制肿瘤细胞增殖行为。因此,为研究EMP3在恶黑中的表达情况及作用机制,本论文首先对TCGA等数据库的患者数据进行生物信息学分析,研究EMP3在恶性黑色素瘤与正常组织中的表达是否有差异,EMP3表达对恶黑患者预后的影响,以及EMP3表达与恶黑患者哪些临床特征存在显著关联,并利用组织标本进行验证。然后,利用si RNA瞬时转染恶黑细胞系,构建EMP3表达下调的细胞模型,进行CCK-8实验、Ed U检测实验、平板克隆实验和细胞迁移实验,研究EMP3的表达对恶黑细胞的活力、DNA合成能力、克隆形成能力、细胞迁移的影响。通过流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡情况,研究EMP3的表达对恶黑细胞周期进程和细胞凋亡的影响。此外,对细胞周期相关蛋白进行检测,分析EMP3调控恶黑的潜在机制,利用生物信息学分析结果和组织标本进行验证,揭示EMP3对恶黑生物学行为的影响和作用机制。结果如下:一、EMP3在恶性黑色素瘤中的表达情况及意义。生物信息学结果显示,EMP3在恶黑组织中的表达显著高于正常组织,EMP3高表达的恶黑患者预后较差。EMP3的表达水平与恶黑患者的年龄、肿瘤类型(原发性或转移性)、Breslow深度存在显著关联。组织标本的免疫组化结果表明,EMP3在恶黑组织中的表达显著高于正常组织。二、EMP3对恶性黑色素瘤细胞的生物学行为的影响。降低恶黑细胞EMP3的表达,可有效抑制细胞活力、DNA合成能力、克隆形成能力和细胞迁移能力,可显著抑制恶黑细胞的细胞周期进程,并促进细胞凋亡。三、EMP3调控恶性黑色素瘤的机制研究及组织验证。降低恶黑细胞EMP3的表达,p21蛋白表达水平升高,cyclin D及cyclin E表达水平没有明显变化,cyclin E-CDK2复合物的形成受到抑制,E2F下游基因(E2F1、c-Myc)转录水平下降,表明EMP3表达下调通过诱导p21升高影响cyclin E-CDK2复合物的形成,抑制E2F下游基因的转录,进而影响恶黑的细胞周期。经过生物信息学结果验证,恶性黑色素瘤中EMP3的表达与E2F1的表达具有正相关性。通过临床标本的免疫组化实验验证,恶黑组织中EMP3的表达与E2F1、c-Myc的表达具有正相关性,进一步表明EMP3通过p21影响cyclin E-CDK2复合物的形成,进而调节E2F下游基因的转录,从而影响恶黑的细胞周期。综上,EMP3在恶性黑色素瘤中的表达水平显著高于正常组织,并且EMP3高表达的恶黑患者预后较差。EMP3的表达水平与恶黑患者的年龄、肿瘤类型(原发性或转移性)、Breslow深度存在显著关联。降低EMP3的表达可以显著抑制恶黑细胞的活力、DNA合成能力、克隆形成能力和细胞迁移能力、同时抑制细胞周期进程并促进细胞凋亡。EMP3通过p21影响cyclin E-CDK2复合物的形成,调节E2F下游基因的转录,进而影响恶黑细胞周期,参与恶黑的发生与发展。本论文为EMP3作为恶性黑色素瘤的生物标志物和治疗靶点提供实验基础。
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