【摘 要】
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目的:探讨CDA1启动子的功能区域及TGFβ1和Smad2siRNASmad3siRNA对其的调节作用。方法:利用PCR和限制性内切酶酶切方法获得不同长度CDA1启动子DNA片段,以基因重组技术构建pGL
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目的:探讨CDA1启动子的功能区域及TGFβ1和Smad2siRNASmad3siRNA对其的调节作用。方法:利用PCR和限制性内切酶酶切方法获得不同长度CDA1启动子DNA片段,以基因重组技术构建pGL3-basic-mCDA1promoter质粒,并用RNA干扰技术构建pAVU6+27-siRNA-Smad2/3重组质粒;应用真核细胞转染技术转染小鼠Leuwis肺癌细胞和RAW264.7细胞。结果:(1)成功构建pGL3-Basic-mCDA1promoter质粒及pAVU6+27-siRNA-Smad2/3质粒,并用半定量逆转录PCR及Western-blotting技术证实pAVU6+27-siRNA-Smad2/3在mRNA水平及蛋白水平特异性抑制了Smad2/3的表达。(2)转染小鼠Leuwis肺癌细胞和RAW264.7细胞均证实pGL3-Basic-mCDA1promoter重组质粒具有活性。(3)用TGFβ1刺激已转染pGL3-Basic-mCDA1promoter重组质粒的细胞,观察到TGFβ1对mCDA1启动子具有上调作用。( 4 )转染pGL3-Basic-mCDA1promoter和pAVU6+27-siRNA-Smad2/3重组质粒到Leuwis肺癌细胞,观察到TGFβ1对Smad2siRNA或Smad3siRNA和mCDA1启动子共同转染时mCDA1启动子活性无明显上调作用或上调作用很弱,而在Smad2siRNA和Smad3siRNA与mCDA1启动子共同转染时,TGFβ1对mCDA1启动子呈现为下调作用。结论:不同长度mCDA1启动子的活性不同,对TGFβ1刺激的反应亦存在差异,Smad2siRNA和Smad3siRNA对mCDA1启动子的活性具有下调作用。本研究首次克隆了不同长度mCDA1启动子区域,并用RNAi技术沉默Smad2和Smad3证实CDA1是TGFβ1的靶基因,通过Smad转导通路来调节。
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