【研究背景及目的】血吸虫病是分布在热带和亚热带地区的一种严重的寄生虫病,全世界感染血吸虫的人数超过2亿。血吸虫尾蚴感染人或动物后,在宿主门脉-肠系膜静脉系统中发育为成虫,雌雄成虫结伴合抱,交配产卵,其中所产虫卵大部分在肝脏、肠道等组织中沉积,卵内毛蚴释放大量可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen,SEA）引发宿主免疫反应,包括肉芽肿性炎症和纤维化反应。血吸虫病最常见的是肠道血吸虫病和肝脏血吸虫病。肠道血吸虫病是一种急性或慢性的特异性肠病,由血吸虫虫卵沉积在结肠和直肠壁引起,可出现腹痛、排便习惯改变和便血等胃肠道症状。肝脏血吸虫病以血吸虫肝纤维化为主要特征,严重者可出现门静脉高压和上消化道出血等,是导致血吸虫病死亡的主要原因。门脉高压可导致脾脏肿大和脾功能亢进,而这些脾脏功能异常又可通过多种途径反过来促进肝纤维化向肝硬化的发展,介导不良预后。与其他疾病所致的肝纤维化相比,血吸虫肝纤维化更易发生脾脏肿大和脾功能异常,目前脾脏切除几乎是唯一治疗手段,但手术风险大,并发症多,且部分患者存在手术禁忌症,因此非手术疗法的开发至关重要;另外,吡喹酮虽然可以杀死成虫,但无法逆转肝纤维化。因此,亟需对血吸虫肝纤维化的发病机制进行深入研究,解析潜在治疗靶点,进而研制高效特异的抗纤维化药物,为血吸虫病的治疗困境提供新的思路。内皮素受体（endothelin receptors,ETRs）属于G蛋白偶联受体超家族,包括内皮素受体A（endothelin A receptor,ETAR）和内皮素受体B（endothelin B receptor,ETBR）。这两种受体可参与多种生物学反应,如调节血压、细胞增殖以及神经嵴发育等。内皮素-1（endothelin-1,ET-1）是至今研究发现的最强的缩血管活性肽,可通过自分泌和旁分泌方式与ETAR和ETBR结合,从而触发细胞的下游信号发挥作用。ETAR和ETBR表达于血管平滑肌细胞,可介导血管收缩;部分ETBR表达于内皮细胞中,可通过释放一氧化氮（nitric oxide,NO）导致血管舒张。研究表明,ET-1及ETRs在肝纤维化及肝硬化进程中发挥重要作用。肝硬化患者血浆中,ET-1的表达水平升高,且与肝脏疾病的严重程度和门脉压力有关;ET-1可以上调肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）上的ETRs,引起HSCs和肝窦收缩,肝内阻力增加,从而导致门静脉高压。正如前文所述,脾脏在肝纤维化和肝硬化的疾病进程中发挥重要作用。在肝硬化合并门脉高压患者中,脾脏产生ET-1增加,从而使得肝内阻力进一步增加,分布在生发中心以及淋巴鞘和卵泡的边缘区域的B淋巴细胞可能是产生ET-1的主要部位。由此我们推测,ET-1的受体ETRs可能与脾脏功能相关,参与肝纤维化及肝硬化进程。目前关于ETRs在血吸虫肝纤维化中的作用及机制的研究较少,且ETAR和ETBR在肝纤维化脾脏组织中的定位表达及作用尚未报道。脾脏作为人体外周免疫器官,在多种疾病的发生发展中起着重要作用。脾脏通过门静脉系统与肝脏相连,脾脏的免疫状态在一定程度上也可以影响肝脏的免疫微环境。脾脏含有大量的B淋巴细胞,其主要特征是受到外来抗原或病原体刺激时,具有分化成可产生抗体的浆细胞的能力。此外,B细胞还可以通过抗体非依赖性机制来发挥免疫保护或免疫损伤作用。蠕虫感染,特别是血吸虫感染,可诱导B细胞活化。B细胞作为调节性免疫细胞网络的成员,可通过多种机制抑制炎症,包括分泌抑制性细胞因子白介素-10（interleukin-10,IL-10）和诱导调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）的活化。本研究,我们拟在血吸虫肝纤维化患者和小鼠模型中的肝脾组织中观察ETAR和ETBR的表达状况,确定其与血吸虫肝纤维化的关系。我们假设ETRs在血吸虫肝纤维化的发病机制中发挥重要作用,并使用内皮素受体拮抗剂验证这一假设,进一步阐明在日本血吸虫感染的疾病进程中,ETRs参与肝纤维化的分子机制,为血吸虫肝纤维化的治疗提供新的思路。【研究方法】1.观察不同分期血吸虫肝纤维化患者的纤维化程度,应用免疫组化的方法对肝脏组织中ETAR和ETBR的表达进行检测;同时对比慢性血吸虫病和慢型乙型肝炎两种病因所致肝纤维化的肝脏组织的病理特征、胶原蛋白沉积以及ET-1和ETRs的表达状况。2.收集慢性血吸虫病和慢型乙型肝炎两种病因导致肝纤维化的脾脏组织,观察脾脏结构的改变以及胶原蛋白沉积的状况,并进一步检测ET-1和ETRs的表达状况;通过免疫荧光技术检测ETAR和ETBR在脾脏组织的定位表达并进行统计学分析;最后,对比分析脾脏切除患者腹部彩超的结果,并将血吸虫患者的结果与ETRs在脾脏组织中的表达进行相关性分析。3.利用日本血吸虫感染诱导肝纤维化小鼠模型,分别在感染4W、6W、8W和12W收集小鼠样本,观察肝脾组织外观,称取总重及肝脾重量计算肝脾指数,检测小鼠血清中谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）和谷草转氨酶（aspartateaminotransferase,AST）水平评估肝损伤程度;同时通过H＆E、Masson和SiriusRed染色观察小鼠病理改变、肉芽肿面积以及胶原纤维沉积状况,并检测小鼠肝脏组织羟脯氨酸的含量变化以及小鼠的门静脉压力及内径;进一步检测小鼠肝脏组织中ET-1和ETRs的表达状况。同时收集感染不同时间的血吸虫肝纤维化的脾脏组织,观察脾脏结构的改变以及胶原沉积的状况,并进一步检测ET-1和ETRs的表达状况。4.观察吡喹酮驱虫治疗联合内皮素受体拮抗剂的疗效。在小鼠感染血吸虫第6周时,在驱虫治疗的基础上,给予内皮素受体拮抗剂治疗6周,观察肝脾组织外观,称重并计算肝脾指数,检测小鼠血清中ALT和AST水平评估肝损伤程度;同时通过H＆E、Masson和Sirius Red染色观察小鼠病理改变、肉芽肿面积以及胶原纤维沉积状况,并检测小鼠肝脏组织羟脯氨酸的含量变化;进一步通过小鼠肝脏组织的H＆E染色观察纤维化区域的面积并进行分析,并应用q PCR和免疫组化方法检测肝脏组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达状况,并测量小鼠的门静脉压力及内径;应用q PCR、western blot和免疫组化方法检测肝脏组织中ET-1、ETAR和ETBR的表达状况;同时ELISA方法检测血清中日本血吸虫特异性Ig G抗体的表达状况及对各组小鼠的肝脏组织进行虫卵计数。同时收集不同分组小鼠的脾脏组织,观察脾脏结构的改变以及胶原沉积的状况,并进一步检测ET-1和ETRs的含量变化。5.应用免疫荧光技术验证ETAR和ETBR在血吸虫小鼠脾脏组织中的定位表达。使用anti-CD20耗竭小鼠体内B淋巴细胞,提取脾脏单个核细胞,体外经SEA刺激培养后ELISA方法检测IL-10的表达。磁珠分选小鼠脾脏B淋巴细胞,观察感染不同时间B细胞释放IL-10含量的变化。应用流式细胞术检测不同分组分选的脾脏B淋巴细胞中IL-10和CD86的改变,进一步用ELISA方法检测细胞培养上清IL-10以及Ig G、Ig M的表达状况;将活化后的B淋巴细胞与CD4+CD25-T细胞共培养,流式细胞术检测不同分组诱导成Treg细胞的比例,并用ELISA方法检测细胞共培养上清IL-10的表达。【结果】1.血吸虫肝纤维化患者肝脏组织内胶原含量随纤维化进展同步增高,免疫组化染色可以看出ETAR和ETBR表达也是随着纤维化进展,表达逐渐增加,且主要集中于炎症和纤维化区域;慢性血吸虫病和慢性乙型肝炎导致的肝纤维化患者的肝脏组织中,小叶结构紊乱,假小叶形成,有大量纤维化区域,胶原纤维沉积明显增加,且血吸虫组可看到虫卵沉积;进一步检测发现ET-1、ETAR和ETBR在两种病因导致的肝纤维化肝脏组织中表达均升高,其中ET-1和ETBR在血吸虫肝纤维化组升高的更为明显。2.肝纤维化患者的脾脏组织红髓充血扩张,白髓缩小,且胶原沉积增多,同时发现肝纤维化组的脾脏组织中Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、ET-1、ETAR和ETBR表达均升高,且在血吸虫肝纤维化组升高的更为明显;进一步通过免疫荧光双染发现,ETAR和ETBR主要表达于脾脏B淋巴细胞,且血吸虫组高于正常组;肝纤维化组的门静脉内径和脾脏厚度显著高于正常组,而且在血吸虫肝纤维化组中,脾脏组织中ETAR和ETBR的分子表达水平与门静脉内径和脾脏厚度呈显著正相关。3.成功建立日本血吸虫肝纤维化小鼠模型。随着感染时间的增加,肝脏质地变硬,脾脏明显增大,肝损伤加重,肉芽肿面积增加,门静脉压力及内径升高,纤维化程度逐渐加重;同时检测发现肝组织中的ET-1、ETAR和ETBR的含量随着感染时间的增加表达上调。随着感染时间的增加,血吸虫肝纤维化小鼠脾脏组织的脾窦扩张淤血,淋巴滤泡结构破坏,伴有小梁增生,但胶原纤维沉积无明显变化,同时发现脾脏组织中ET-1、ETAR和ETBR的含量随着感染时间的增加逐步增加。4.吡喹酮治疗可显著减少日本血吸虫小鼠体内成虫及虫卵负荷。内皮素受体拮抗剂可显著减轻日本血吸虫感染诱导的肝损伤和脾脏肿大;不同分组中的肉芽肿面积无显著差异;进一步研究发现,与非治疗组相比,内皮素受体拮抗剂治疗组中胶原纤维沉积、羟脯氨酸含量、纤维化区域面积以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达均明显降低,同时发现拮抗剂治疗组中小鼠的门静脉压力与内径亦下降;ET-1、ETAR和ETBR在治疗组小鼠的肝脏组织中的表达显著降低;日本血吸虫特异性Ig G抗体在治疗组中表达降低,而不同分组的虫卵计数无差异。治疗组小鼠脾脏组织的实质结构破坏减少,脾窦扩张淤血减轻,淋巴滤泡结构破坏亦有所下降,但各组之间的胶原含量并未发现显著差异;ET-1、ETAR和ETBR在治疗组小鼠的脾脏组织中表达降低。5.免疫荧光结果提示,ETAR和ETBR在脾脏组织中主要由B淋巴细胞表达。耗竭B细胞后,IL-10的分泌明显减少;血吸虫感染第8W,脾脏B细胞释放IL-10开始增加,且在感染第12W更高;与非治疗组相比,内皮素受体拮抗剂治疗组中CD19+IL-10+B细胞比例显著下降,CD86表达降低;B淋巴细胞体外培养上清中IL-10、Ig G和Ig M的表达降低;进一步检测发现治疗组的小鼠脾脏B淋巴细胞诱导Treg分化能力降低,且细胞共培养上清中IL-10含量亦显著下调。【结论】1.在慢性血吸虫病和慢性乙型肝炎两种病因导致肝纤维化患者的肝脾组织中,ETRs的表达升高,同时发现其在血吸虫肝纤维化患者脾脏组织中升高更为明显,且主要表达于B淋巴细胞;血吸虫肝纤维化患者脾脏组织中ETRs的表达与肝纤维化程度呈正相关性。2.在血吸虫肝纤维化小鼠模型中,随着感染时间的增加,肝损伤及肝纤维化程度逐渐加重,脾脏结构进行性破坏,肝脏和脾脏组织中ETRs的含量逐渐升高,且在脾脏组织中主要由B淋巴细胞表达。3.内皮素受体拮抗剂可显著减轻日本血吸虫诱导的小鼠纤维化程度和脾脏结构破坏,并下调肝脾组织中ETRs的表达。4.日本血吸虫感染可诱导B细胞活化,此可被内皮素受体拮抗剂所抑制,其内在机制为内皮素受体拮抗剂下调了B淋巴细胞IL-10的分泌和诱导Treg细胞活化的能力。5.综上所述,内皮素受体拮抗剂发挥抗日本血吸虫肝纤维化的作用机制可能与抑制脾脏B淋巴细胞活化有关。