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疼痛是一类复杂的感觉,是一种不愉快的感觉和情绪体验,往往伴随有实际的或潜在的组织伤害,是临床上最常见的病症之一,且具有显著年龄差异。慢性疼痛起源于周围神经系统的伤害感受器,目前关于热伤害感受的知识主要局限于温度传感器,包括背根神经节（DRG）伤害感受神经元中表达的瞬时受体电位阳离子通道TRPV1通道。伤害感受器神经元兴奋性升高或对刺激的反应提高是疼痛产生的重要机制,而神经元细胞膜上的电压门控钠离子通道被激活产生的动作电位也是疼痛产生的主要因素之一。热传感器损失只是部分损害了热伤害感受,伤害性信号的转导也需要钠通道（Nav）辅助,但其中存在的调控机制尚未阐明。因此,本论文主要聚焦在TRP通道与Na+通道的两种基因敲除小鼠,以基因敲除小鼠发育为背景,以基因敲除小鼠的周龄变化为基础,综合应用行为学、分子生物学（荧光定量PCR）、电生理学等技术,来探究在发育过程中TRP通道亚型与Na+通道亚型对机械痛和热痛敏的影响。更进一步揭示两者（机械痛和热痛）在发育过程中相互作用的细胞分子调控机制。实验方法:1.应用弗莱毛测痛法和热板法测定TRPV1基因型小鼠(即TRPV1+/+、TRPV1+/-、TRPV1-/-)和Nav1.6基因型小鼠(即Nav1.6+/+、Nav1.6+/-、Nav1.6-/-)的机械痛阈和热痛阈,由于Nav1.6-/-小鼠在大约21天自然死亡,因此无法进行后续实验。2.应用qRT-PCR实验方法,检测在正常生理状态下,1W-8W龄TRPV1敲除鼠和Nav1.6敲除鼠在DRG神经元上TRP通道各亚型和Na+通道各亚型的表达。3.采用全细胞膜片钳实验方法,检测Nav1.6通道和TRPV1通道DRG神经元早期发育电流变化。结果如下:1.43℃热刺激下对小鼠行为发育响应变化连续热刺激下,与野生型小鼠相比,TRPV1基因敲除后,小鼠体长发育不受影响,而小鼠体重减轻;与野生型小鼠相比,TRPV1+/-、TRPV1-/-小鼠在1W时,机械痛阈升高,且在1W时出现显著性差异（P<0.05）,3W-8W上述三种类型小鼠的机械痛阈无差异;而对于热刺激,TRPV1+/-、TRPV1-/-小鼠的左右缩足潜伏期均升高,在1W和2W时有显著性差异（P<0.05）,3W-8W上述三种类型小鼠的机械痛阈无差异。可见,连续43℃热刺激及TRPV1基因敲除后,小鼠体长发育无变化,而体重减轻,早期机械痛阈上调,热痛反应潜伏期增长,影响小鼠早期发育。小鼠出生1W-8W,连续43℃热刺激TRPV1野生型小鼠的体长和体重均高于不连续43℃热刺激TRPV1野生型小鼠,且存在显著性差异（P<0.05）。提示,不连续43℃热刺激影响小鼠的生长发育;在机械刺激实验中,不连续43℃热刺激机械痛更为敏感;而在检测热刺激引起的缩足潜伏期变化时,缩足潜伏期阈值逐渐增加;出生2W时,与连续43℃热刺激TRPV1野生型小鼠相比,不连续43℃热刺激TRPV1野生型小鼠的缩足潜伏期阈值显著增加（P<0.05）,可见不连续43℃热刺激影响小鼠的生长状况和对疼痛的感知。Nav1.6+/+和Nav1.6+/-两种基因型小鼠的机械阈值随周龄增长呈现递增趋势。与野生型小鼠比较,1W-7W龄Nav1.6+/-小鼠的机械痛阈降低,6W、7W均具显著性差异（P<0.01）,而到8W时,两种基因型小鼠痛阈无差异;连续43℃热刺激下,Nav1.6+/+,Nav1.6+/-小鼠体长、体重之间长幅一致,Nav1.6-/-小鼠体长、体重均明显小于Nav1.6+/+,约21天死亡;随周龄增长,两种基因型小鼠缩足潜伏期呈现降低趋势;连续43℃热刺激下,与野生型小鼠相比,Nav1.6基因缺失(Nav1.6+/-)小鼠热痛反应潜伏期显著降低（P<0.05）。在连续43℃热刺激下,Nav1.6基因缺失(Nav1.6+/-)或敲除(Nav1.6-/-)后,小鼠体长发育减缓;机械痛与热痛反应敏感度增加。2.痛敏相关基因在DRG上mRNA的表达发育变化通过qRT-PCR技术检测TRPV1+/+、TRPV1+/-、TRPV1-/-、Nav1.6+/+、Nav1.6+/-小鼠DRG神经元细胞中与痛敏相关基因mRNA表达情况。Na+通道各亚型与TRP通道各亚型在TRPV1三种转基因型小鼠DRG神经元细胞上均有表达。随周龄增长,TRP通道各亚型与Na+通道各亚型mRNA表达量总体呈现上调的趋势。TRPV1基因敲除后,与野生型小鼠相比,TRPA1基因与TRPV1基因表达下调,相反,Na+通道各亚型mRNA表达上调,以2周龄最为显著。提示,TRPV1基因敲除后差异性调节Na+通道和TRP通道的表达。Na+通道各亚型与TRP通道各亚型在Nav1.6敲除小鼠DRG神经元细胞上均有表达。随周龄增长,野生型小鼠mRNA表达量总体呈现下调趋势,而杂合型小鼠mRNA表达量总体呈现上调趋势,以出生后3周龄最为明显。Nav1.6基因敲除后,Na+通道亚型、TRPA1、TRPV1、TRPV2、TRPV4 mRNA表达量上调。提示,Nav1.6基因敲除后影响Na+通道和TRP通道的表达。因此,TRPV1与Nav1.6基因敲除后影响Na+通道和TRP通道的表达,推测两种通道亚型存在一种互作代偿机制。3.TRPV1与Na+通道电流的发育变化通过全细胞膜片钳技术检测TRPV1+/+、TRPV1+/-、TRPV1-/-小鼠DRG神经元细胞中的电流表达发育情况。结果显示,2W龄TRPV1+/-小鼠DRG神经元细胞的峰值电流约为2300 pA,反转电位在30 mV,激活电位在50 mV。TRPV1+/+小鼠4W的电流峰值电流在约4000 pA,反转电位在18 mV,激活电位在60 mV。TRPV1+/+小鼠5W的电流峰值电流在约2400 pA,反转电位在25 mV,激活电位在60 mV。TRPV1+/+小鼠4W和5W相比,5W小鼠的峰值电流变小,失活减慢。TRPV1三种基因型小鼠2W电流比较,TRPV1基因敲除后,峰值电流减小,Na+通道抑制激活,延缓失活。结论:1.揭示了连续43℃热刺激及TRPV1基因敲除后降低小鼠的基础代谢,且对有害刺激的感知能力降低。其中1W-2W为其关键时期。2.揭示了不连续43℃热刺激影响小鼠体长和体重的生长,对有害刺激的感知能力降低。其中1W-2W为其关键时期。3.揭示了连续43℃热刺激及Nav1.6基因敲除后,小鼠体长不受影响,而体重减轻,对疼痛的感知更为敏感。4.揭示了TRPV1与Nav1.6基因敲除后影响Na+通道和TRP通道的表达,推测两种通道存在一种互作代偿机制,Na+通道不仅可以介导动作电位的传播,也可以响应热。