本研究以龙眼(Dimocarpus longan Lour.)“红核子”胚性愈伤组织(Embryogenic callus, EC)为材料,对以下8个方面进行研究:①龙眼胚性愈伤组织CDC48基因(cell division cycle 48)cDNA和DNA克隆;②CDC48基因的原核表达;③龙眼胚性愈伤组织CDC48基因的生物信息学分析;④龙眼胚性愈伤组织GPX (glutathione peroxidase)cDNA和DNA克隆;⑤GPX基因的原核表达;⑥龙眼胚性愈伤组织GPX的生物信息学分析;⑦以龙眼UBQ和EF-1a 2个基因共同作为内参基因,利用荧光定量PCR技术分析龙眼体胚发生过程各阶段培养物中龙眼CDC48和GPX基因转录水平表达变化;⑧分析龙眼体胚发生过程各阶段培养物及逆境胁迫处理下龙眼EC GPX活性变化。主要研究结果如下:1.龙眼胚性愈伤组织CDC48基因cDNA和DNA全长的获得以龙眼EC为材料,应用同源克隆结合RACE技术,获得了龙眼胚性愈伤组织CDC48的cDNA全长为为2620 bp,其中5’UTR为17 bp,3’UTR为187 bp,3’端还含有13个poly(A)尾。该序列与登录GenBank的其它植物CDC48基因有很高的同源性。序列分析发现拼接的cDNA含有一个2415 bp的开放阅读框,编码805个氨基酸,ATG为起始密码子、TAG为终止密码子。将此基因命名为DLCDC48,并在GenBank上登录,登录号为EU606206。从DNA水平克隆也得到了龙眼胚性愈伤组织的CDC48基因,并且经测序证实该基因无内含子,在GenBank上登录,登录号为:FJ590953。2.龙眼胚性愈伤组织CDC48基因原核表达根据龙眼EC CDC48全长cDNA的序列分析,在可能的ORF区域设计一对添加限制性内切酶的特异引物,进行ORF片段扩增并将其克隆到表达载体pET-28 a中。将构建好的表达载体在大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行融合表达。经过诱导,SDS-PAGE分析发现宿主菌中有一个分子量约为89 kD的新蛋白出现。该诱导表达的蛋白分子量与理论推导龙眼EC CDC48的分子量89.5 kD相近。3.龙眼胚性愈伤组织CDC48基因的生物信息学分析应用生物信息学软件对龙眼胚性愈伤组织CDC48的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析。结果表明: CDC48蛋白的分子量是89564.8 Da,理论等电点pI 4.92,是不具跨膜结构域的亲水性胞质蛋白,不具有信号肽,主要定位在细胞核上,有3个区域最有可能形成卷曲螺旋,由40.87%的a螺旋、15.28%的延伸链和43.85%的不规则卷曲组成,磷酸化位点有39个。保守结构域与功能域分析龙眼CDC48具有两个典型的ATPase模块,以及含有CDC48特有的N端。通过功能的预测与分析,推测与细胞的分裂有关系。通过其氨基酸序列的系统进化树分析,CDC48的进化在一定程度上反应了植物的进化。此外,还对CDC48酶分子三维立体结构等进行了预测和分析。4.龙眼胚性愈伤组织GPX基因cDNA和DNA全长的获得以龙眼EC为材料,应用同源克隆结合RACE技术,获得了龙眼胚性愈伤组织GPX的cDNA全长cDNA全长为947 bp, 5’UTR为195bp,3’UTR为245 bp,区域还含有典型的加尾信号AATAA和poly(A)尾。该序列与登录GenBank的其它植物GPX基因有很高的同源性。序列分析发现拼接的cDNA含有一个504 bp的开放阅读框,编码168个氨基酸,ATG为起始密码子、TAA为终止密码子。将此基因命名为DLGPX,并在GenBank上登录,登录号为EU364813。从DNA水平克隆也得到了龙眼胚性愈伤组织的GPX基因,1736 bp核苷酸序列,有ATG起始密码子和TAA终止密码子,并在GenBank上登陆,登陆号为:EU680970。通过DNAMAN 6.0软件分析,GPX基因由5个外显子和4个内含子组成,所有内含子的剪切位点均符合真核生物GT-AG规则。5.龙眼胚性愈伤组织GPX基因原核表达根据龙眼EC GPX全长cDNA的序列分析,在可能的ORF区域设计一对添加限制性内切酶的特异引物,进行ORF片段扩增并将其克隆到表达载体pET-28 a中。将构建好的表达载体在大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行融合表达。经过诱导,SDS-PAGE分析发现宿主菌中有一个分子量约为23 kD的新蛋白出现。本研究所用的酶切位点为SacI和XhoI,把载体上额外翻译的38个氨基酸一起表达。龙眼GPX编码基因产物的理论推导分子量18.54 kD,加上额外翻译的氨基酸理论推导分子量为4.08 KD(38个氨基酸理论推导分子量为39.45 KD),总共为22.62KD,与本研究结果相符。6.龙眼胚性愈伤组织GPX基因生物信息学分析运用生物信息学软件对龙眼胚性愈伤组织GPX基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析。结果表明:GPX蛋白的分子量是18541.16Da,理论等电点pI 7.18,是不具跨膜结构域的亲水性胞质蛋白,不具有信号肽,细胞主要定位在细胞质上,有1个区域最有可能形成卷曲螺旋,由27.98%的a螺旋,20.249%的延伸链和51.79%的不规则卷曲组成,磷酸化位点有13个。龙眼胚性愈伤组织GPX氨基酸序列含有PHGPX的两个特征序列,推测所克隆到的可能是GPXs家族中保护膜免受损伤的PHGPX的cDNA序列。此外,还对GPX酶分子三维立体结构等进行了预测和分析。7.龙眼胚性愈伤组织CDC48和GPX基因转录水平表达分析用龙眼胚性培养物中UBQ和EF-1a 2个基因共同作为内参基因,利用荧光定量PCR技术分析龙眼体胚发生过程各阶段培养物龙眼CDC48和GPX基因转录水平表达变化。分析结果显示:龙眼CDC48在体胚发生过程中都有不同程度的表达,其中胚性紧实球形结构阶段表达量最大,其次是胚性愈伤组织,最低的是球形胚;龙眼GPX在体胚发生过程中也均有不同程度的表达,其中胚性紧实球形结构阶段表达量最大,其次是子叶胚,最低的是胚性愈伤组织。8.龙眼体胚发生过程中GPX酶活性变化GPX活性在龙眼体胚发生过程中也均有不同程度的表达,其中胚性紧实球形结构阶段表达量最大,其次是子叶胚,最低的是胚性愈伤组织,这与龙眼体胚发生过程中基因相对定量表达结果是一致的;以龙眼胚性细胞系LC2为材料,研究了在NaCl、光和温度胁迫下龙眼胚性愈伤组织GPX酶活性的变化规律。分析结果显示:在一定逆境胁迫下,细胞内GPX可以起到应答外界刺激的作用,且活性呈规律表达,推测GPX活性变化与胚性细胞抗逆性正相关,是植物在逆境胁迫下防御ROS伤害的主要标志之一。总之,本研究克隆了与体胚发生过程有密切相关的2个基因,进行了表达分析,并比较全面地预测和分析了它们的结构和功能,加深了对龙眼体胚发生机制的理解,为构建龙眼体胚发生的基因网络提供新的资料,为研究龙眼体胚发生过程中的细胞发育调控和活性氧的清除等方面的机理提供有价值的证据,为利用基因工程方法进行龙眼和其它植物胚胎发育调控等方面的遗传改良提供基因资源。