论文部分内容阅读
神经营养因子是指机体产生的能够促进中枢和外周神经细胞存活、生长和分化的多肽生长因子。神经营养因子既可以影响发育早期胚胎神经元或者前体细胞的生长与分化，还能够促进成熟神经细胞的存活与生长，而且它对于治疗一些神经系统退行性疾病或促进神经损伤后修复具有非常重要的作用。 神经营养因子结合并作用于神经营养因子受体，激活胞内信号通路后，才能发挥其重要的生物学效应。神经营养因子以其化学组成和受体的特性等可以分为多个家族，如GDNF家族、NGF家族等。GDNF、NGF、EGF的生物学效应分别由GDNF受体RET、NGF受体TrkA及EGF受体EGFR所介导。尽管上述配体不尽相同，但它们的受体均属于受体酪氨酸激酶（RTK）。近几年来，为了更多地理解为何不同的配体、受体可引起类似或特定的生物学效应，人们对于细胞内由这些受体介导多种信号通路的研究越来越重视。大量工作表明，配体与受体结合，引起受体的二聚化并同时激活受体后，受体可结合大量的信号蛋白分子，如接头蛋白、入坞蛋白或各种调节蛋白等。正是由于大量不同信号分子不断整合的结果，多种不同的信号得以正确传递。发现并了解这些参与受体下游通路转导的信号分对于人们更好地理解胞内信号通路无疑具有重要的意义。 因此，本研究应用酵母双杂交筛选文库的方法，寻找胞浆内神经营养因子受体酪氨酸激酶的可能底物或调控蛋白，为进一步探索受体下游的具体信号转导或调节机制打下基础。 本研究的主要结果如下： 1、将RET胞内域与LexA蛋白融合构建成pGilda-RETIC，确认无自激活作用后，将其作 第H军医大学博士学位论文 口摘要（中英文） 为诱饵蛋白，经酵母双杂交方法筛选人脑LexA cDNA文库，获得274个克隆。经p－半乳糖 苦酶活性鉴定和测序分析进一步鉴别，筛选到21个质粒片段，从中获得并明确为SHZE等 基因片段。将pGilda－RET厂与pB42ADS 书共转化HLYSIg，共转化子的 p－半乳糖昔酶活 力检测呈阳性，表明在酵母中S＊2丑与RE丫”之间可相互作用。在获得稳定转染M T与＊F＊。 质粒的PC 12细胞基础上，再瞬时转染野生型SHZE或者其突变体R555E于此稳定转染细胞 株中。细胞裂解物的免疫共沉淀实验结果显示，仅当 GDNF刺激转染了野生型SHZ－B的 PC 细胞时，可以检测到RET与SHZE的结合。此结果表明，GDNF刺激过量表达RET、GFRa 与 SHZ－B的PC细胞后，SHZ－B可与 MT在体内发生结合。细胞的形态观察显示，GDNF 作用于仅转染RET与 GFRa质粒的PC细胞或转染MT、GFRa与 SHZ8质粒的PC细胞后， 细胞的分化均较明显；而作用于转染RET、GFRa与SHZE突变体R555E质粒的PC12细胞后， 分化程度明显降低，具有统计学意义。上述结果表明，MT与SHZE的结合可能参与GDNF 刺激引起PC细胞分化的信号通路。 2、将EGFR胞内域与LexA蛋白融合构建成pGilda七GFR＼确认无自激活作用后， 将其作为诱饵蛋白，经酵母双杂交方法筛选人脑 LexA cDNA文库，获得 112个克隆。经 p－半乳糖昔酶活性鉴定和测序分析进一步鉴别，筛选到6个质粒片段，从中获得并明确为 doki等基因片段。将 pGilda－EGFR’C与 pB42AD－doki共转化 HLY819，共转化子的p－半乳 糖昔酶活力测定呈阳性，表明在酵母中 doki与 EGFR‘C可结合。pGildUEGFR’C与 pB42AD刁ok1PTB酵母共转化子的p－半乳糖昔酶活力以及 SD Gal Ura“His”Tp’Leu”平板生 长实验均呈阳性，表明 doki可经 PTB结构域与 EGFR’C结合。缺失 PTB结构域的 doki门 doki A PTB)与EGFR‘’共转化子的p－半乳糖昔酶活力以及SD Ga1Ura”His’切“Leu平板生 长实验均呈阴性，从而进一步从反面证实doki可经PTB结构域与EGFR‘“结合。兔疫共沉 3 — — 淀的实验结果，进一步证实了在酵母中d。hi可经PTB结构域与EGFRIC相互作用。根据 doki PTB结构域与来自EGFR小肽的立体结构模拟提示，我们选择了d。k1PTB结构域内的 八个氨基酸残基进行突变，即73Y、74T、76L、77R、79Y、92R、93R与119I，每个氨基 酸残基均突变为丙氨酸 Ala，再将这些 dok1PTB突变体与 EGFR’“共转化酵母 HLY819，检 测共转化子的－半乳糖昔酶活力。结果显示，当PTB结构域内的73Y、76L、77R或92R 突变为川a后，EGFR’”不能与 doklPTB结合；而 74T。79Y、93R与 119I突变为 Ala后， EGFR厂仍可与 d。klPTB结合。上述结果表明，d。k1PTB结构域内的 73Y、76L、77R和 92R残基在EGFR与doki的结合中具有重要作用。 3、将TrkA胞内域与LexA蛋白融合构建成pGilda－Ti＊，确认无自激活作用后，将其