狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒感染引起的一种急性致死性人兽共患传染病,一旦发病死亡率几乎为100%。犬瘟热、犬细小亦是造成犬科动物发病死亡的重要传染病。目前,疫苗接种是预防狂犬病、犬瘟热、犬细小最为经济有效的方法。本研究团队利用反方向遗传学技术将狂犬病病毒的G基因提前,敲除其毒力基因,并将犬瘟热病毒和犬细小病毒的主要抗原基因CDV-N、CPV-VP2插入到狂犬病病毒基因组构建重组狂犬病病毒,有望获得基因重排减毒狂犬病疫苗株、犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒的二联弱毒苗株、犬瘟热病毒N基因-犬细小病毒VP2基因重组狂犬病病毒的三联弱毒苗株。以期为将来制备狂犬病减毒口服活疫苗、犬瘟热-狂犬病二联口服弱毒活疫苗、犬瘟热-犬细小-狂犬病三联弱毒活疫苗奠定基础。首先,为了探究基因重排减毒狂犬病病毒、犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒(CDV-N重组狂犬病病毒)的拯救及鉴定。利用反向遗传学技术,通过脂质体转染的方法,将纯化后的全长重组质粒与4个辅助性表达质粒共转染BSR细胞;通过RT-PCR技术、间接免疫荧光试验对重组病毒进行鉴定。结果显示,RT-PCR检测出现与预期相符的目的片段;激光共聚焦显微镜观察发现,试验组出现了大量的荧光灶点,空白对照组未见绿色荧光;间接免疫荧光鉴定结果与RT-PCR检测结果相符,表明基因重排减毒狂犬病病毒、CDV-N重组狂犬病病毒拯救成功。其次,探究基因重排减毒狂犬病病毒、CDV-N重组狂犬病病毒、CDV-N-CPV-VP2重组狂犬病病毒对小鼠的免疫效果及安全性评估。利用ELISA试剂盒对狂犬病毒、犬瘟热病毒的特异性抗体进行检测。结果显示:三种重组狂犬病病毒株口服免疫产生的狂犬病毒抗体水平均显著高于亲本毒株Srv9口服免疫组。CDV-N重组狂犬病病毒、CDV-N-CPV-VP2重组狂犬病病毒均可刺激小鼠机体产生狂犬病毒抗体和犬瘟热病毒抗体;病理组织学检查结果表明口服免疫组的安全性优于注射免疫组。最后,探究了基因重排减毒狂犬病病毒、CDV-N重组狂犬病病毒、CDV-N-CPV-VP2重组狂犬病病毒对犬的口服免疫效果。利用ELISA试剂盒对狂犬病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒的特异性抗体进行定量检测。结果显示均能诱发机体产生其特异性抗体,且到第35天时各免疫组血清狂犬病毒抗体水平均高于世界卫生组织推荐的最低保护水平0.5 IU。