背景肝纤维化（Liver fibrosis,LF）是病毒性肝炎、酒精肝、代谢相关脂肪性肝病、自身免疫性肝病等多种慢性肝病向肝硬化及肝癌发展的中间病理过程。肝纤维化发展过程中,过量细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）沉积引起了肝脏微结构和肝窦内皮细胞（Liver sinusoidal endothelial cells,LSECs）力学微环境的显著变化,导致肝脏弹性下降,硬度可达正常肝脏的6倍。失窗孔化的LSECs通过分泌促炎和促纤维化因子激活肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSC）分泌ECM并积累;ECM的大规模积累反过来又限制肝窦微血管的血液流动,导致肝窦体腔的狭窄和变形,引起缺氧加重毛细血管化。由此可见,在肝纤维化的发生发展过程中,病理微环境的力学变化既是纤维化发展的结果,也是促使疾病进展的原因。探讨内皮细胞与ECM微环境之间力学信号的感知和传递机制是肝纤维化研究中的一项重大挑战。细胞通过机械感应受体感知细胞外机械力变化,并将这些信息转化为引发生物反应信号事件的过程称为机械力传导（mechanotransduction）。生理条件下,生物力学信号普遍存在于人体中,而且参与调节基本生命活动;病变过程也会伴随生物力学信号的改变,为病变部位的靶向治疗提供潜在可能。目前药理学中的药效机制研究大多依赖于病变组织或细胞中的生物化学信号,内皮细胞对机械力的感知以及如何将这种生物力转化为机械-生物反应机制是目前研究的热点。在药理学领域,发生效力是药物使用的最终目标,而微环境物理机械力的调节可获得不同的生物学效应,从而我们也可以将“生物力”认为是一个多靶点的“药物”。生物力药理学（biomechanopharmacology）考虑药物与力学因素的联合作用,一方面考虑药物本身的药效作用;另一方面,药物也可能通过调整体内生物力环境,促进机械力传导诱发生物反应,从而产生继发的药理效用。芪术颗粒是首都国医名师姚乃礼教授结合多年临床实践总结而出的临床有效方剂,至今已使用超过30余年;芪术颗粒研究于1 996年被列为国家九·五攻关课题,其中“芪术颗粒抗肝纤维化的临床与实验研究”获中国中医研究院科技进步二等奖,北京市科技进步二等奖。前期研究表明,芪术颗粒具有减少Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原形成、抗ECM沉积、抑制HSC增殖的作用;同时可降低肝纤维化大鼠肝脏中肝窦微血管密度,减少肝窦微血管增生,防止肝窦毛细血管化;另外,芪术颗粒还有助于维持LSECs窗孔数量及直径,其对正常窗孔表型的维持与调节LSECs的细胞骨架变化有关,但是其调节ECM微环境力学性质的作用与其抗肝窦毛细血管化功效之间的关系仍不清楚。本研究针对芪术颗粒的肝弹性调节效用,从生物力药理学的角度出发,探讨其抗肝窦毛细血管化机制,体现中药应用的多靶点、多层次综合药理作用,旨在为中药抗肝纤维的临床及基础研究提供新思路新方法。实验目的本研究包括动物实验和细胞实验两部分,总目的为探索芪术颗粒通过调节基质硬度引发机械力传导发挥抗肝窦毛细血管化的生物力药理学机制,具体包括:1.动物实验目的（1）芪术颗粒抗肝窦毛细血管化的有效性研究;（2）芪术颗粒对肝组织硬度调节的作用研究;（3）芪术颗粒抗肝窦毛细血管化与肝脏硬度调节关系的生物信息学分析;（4）芪术颗粒对肝纤维化小鼠肝脏转运代谢功能的评价研究。2.细胞实验目的（1）构建不同硬度2D水凝胶基底及原代小鼠LSECs提取;（2）不同基底硬度对LSECs毛细血管化的影响作用研究;（3）基质硬度调控LSECs窗孔变化的机械力传导机制探索。实验方法1.动物实验:通过CCl4腹腔注射诱导建立肝纤维化小鼠模型,设置空白组、模型组、阳性药物/水飞蓟宾组、芪术颗粒低剂量组、芪术颗粒中剂量组、芪术颗粒高剂量组,主要目的为研究芪术颗粒抗肝窦毛细血管化及调节肝组织硬度的有效性,并对其调节肝脏硬度与抗肝窦毛细血管化之间的关系进行生物信息学初步预测和分析。（1）动物实验第一部分首先对芪术颗粒的抗肝窦毛细血管化作用进行研究:方法采用环境扫描电子显微镜（EnvironmentalScanningElectronMicroscope,ESEM）对肝窦壁表面窗孔进行直接观察;蛋白免疫印迹法（Western blotting,WB）半定量检测LSECs的窗孔调节蛋白内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase,eNOS）及小窝蛋白（caveolin-1,Cav-1）表达;肝组织免疫荧光染色对肝窦毛细血管化标志分子CD31进行表达半定量检测;WB半定量测定肝组织内CD31及血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor A,VEGFA）表达。（2）动物实验第二部分对芪术颗粒的肝组织硬度调节作用进行研究:首先采用肝脏超声活体检测、肝组织冷冻后切片原子力显微镜（Atomic Force Microscopy,AFM）杨氏模量检测、肝组织弹性拉等对肝脏组织硬度进行直接力学检测;然后对肝组织的ECM进行检测以间接反应肝组织硬度,方法采用肝组织切片HE及天狼星红染色、肝组织切片免疫荧光染色基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2.MMP-2）和 Ⅰ 型胶原（Collagen Ⅰ,Col-Ⅰ）、血清学基质成分分析（包括Ⅲ型前胶原（Procollagen Ⅲ,PCⅢ）,Ⅳ型胶原（collagenⅣ,Ⅳ-C）,层粘连蛋白（Laminin,LN）,透明质酸（hyaluronan,HA））。（3）动物实验第三部分对芪术颗粒抗肝窦毛细血管化与肝脏硬度调节之间的关系进行了生物分子机制预测和分析;方法采用ceRNA基因芯片,对芪术颗粒治疗组、模型组、空白组肝组织进行mRNA、miRNA、circRNA及lncRNA差异基因分析,构建ceRNA调节网络,以分析及预测芪术颗粒抗肝窦毛细血管化与肝脏硬度调节的关系。（4）动物实验第四部分对芪术颗粒调节肝纤维化转运代谢功能进行评价:方法采用小动物近红外光声成像技术对肝纤维化小鼠的吲哚菁绿（Indocyanine Green,ICG）转运代谢能力进行实时成像监测。2.细胞实验:为进一步探索细胞外基质硬度变化对肝窦毛细血管化的影响作用,实验构建了不同梯度硬度水凝胶2D培养基底,提取小鼠原代LSECs培养并观察。（1）细胞实验第一部分首先构建了不同硬度2D水凝胶基底并提取小鼠原代LSECs培养:方法采用聚丙烯酰胺水凝胶（Polyacrylamide Hydrogel,PAM）构建分别模拟健康、肝纤维化进展期和肝纤维化后期/早期肝硬化小鼠的肝脏硬度,同时设置玻璃皿底作为对照组;原代LSECs提取选用与动物实验一致的C57BL/6J小鼠,在课题组前期大鼠LSECs提取基础上优化完善,采用密度梯度离心法贴壁分离获得小鼠原代LSECs.（2）细胞实验第二部分观察研究了不同基底硬度对LSECs毛细血管化的影响作用:方法采用ESEM对LSECs表面窗孔进行直接观察;免疫荧光标记LSECs骨架及CD31进行表达半定量检测。（3）细胞实验第三部分对基质硬度调控LSECs窗孔的机械力传导机制进行了初步探索:方法采用DAF-FM DA探针溶液对LSECs进行标记,利用Ca2+载体A23187作为诱导剂对不同硬度基底的LSECs进行NO释放刺激,在激光共聚焦显微镜下实时监测LSECs的NO释放情况。实验结果1.动物实验结果（1）芪术颗粒抗肝窦毛细血管化的研究结果:①环境扫描电镜对肝窦璧表面扫描成像观察,结果显示,中药治疗组肝窦璧表面窗孔数量及直径维持正常,而模型组肝窦表面窗孔数量及直径减少,肝窦表面趋向光滑呈现出典型的肝窦毛细血管化状态;②WB蛋白检测分析显示,芪术颗粒对LSECs的窗孔调节蛋白eNOS及caveolin-1具有调节作用,其中eNOS表达上调,caveolin-1表达下调。③免疫荧光及WB蛋白检测分析显示,芪术颗粒对促毛细血管化因子VEGFA及毛细血管化标志因子CD31具有下调作用。综合以上实验结果证明芪术颗粒具有抗肝窦毛细血管化的作用,其作用机制可能与调控eNOS及caveolin-1表达以调节LSECs窗孔形貌、及降低VEGFA表达有关。（2）芪术颗粒调节肝组织硬度的研究结果:①肝脏超声结果显示,模型组小鼠肝脏较空白组肝实质超声增强、粗糙,肝实质区域灰度值增高,芪术颗粒低中高剂量治疗组与模型组比较,肝实质回声明显降低,灰度值明显减小,说明芪术颗粒能够明显降低肝脏硬度,且治疗组具有降低门静脉内径的作用趋势;②原子力显微镜对肝组织冷冻切片的杨氏模量检测结果显示:模型组肝组织杨氏模量较正常组显著升高,芪术颗粒治疗组的肝组织切片杨氏模量较模型组显著下降,说明芪术颗粒降低肝纤维化组织硬度;③对新鲜肝组织拉伸测试曲线结果显示芪术颗粒治疗组明显改善肝纤维化组织弹性,与模型组具有显著差异,结果说明芪术颗粒提高了肝组织弹性降低组织硬度,与AFM测试结果一致。④肝组织切片HE及天狼星红染色结果显示,肝纤维化模型小鼠肝脏大体观质地粗糙、表面颗粒感明显、颜色暗淡少光泽;HE染色见肝索紊乱,肝细胞坏死、核固缩,假小叶形成;天狼星红染色见大量特异性红染胶原纤维,形成假小叶。芪术颗粒治疗组明显改善肝窦紊乱、肝细胞坏死及炎症情况,同时显著降低肝纤维化小鼠胶原纤维沉积。⑤本研究利用免疫荧光检测技术,对各组肝组织内的基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和Ⅰ型胶原（Collagen I,Col-Ⅰ）进行荧光标记并统计学分析,结果表明芪术颗粒显著提高MMP-2表达并降低Col-Ⅰ水平,这说明芪术颗粒具有直接降解ECM的药理作用;⑥血清学检测结果显示,芪术颗粒显著减少肝纤维化细胞外基质成分PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA的组成。综合以上结果,表明芪术颗粒对肝脏组织硬度具有调节作用,作用机制与减少胶原纤维沉积,降低细胞外基质成分 Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA,提高 MMP-2 表达有关。（3）ceRNA基因芯片对芪术颗粒抗肝窦毛细血管化与肝脏硬度调节之间的关系进行了生物分子机制预测和分析,检测结果显示:空白组、模型组和芪术颗粒治疗组间差异基因大量与ECM有关,进一步的GO富集及KEGG通路富集将差异基因对应细胞组分、功能及生物过程和分子通路结果显示,芪术颗粒对ECM成分（如Ⅳ型胶原、纤维蛋白等）及其生成降解生物过程均具有显著关联性,KEGG富集也多次富集到与TGF-β信号通路、PI3K-Akt信号通路、ECM-受体相互作用通路等;对差异基因分别构建circRNA-miRNA-mRNA 及 lncRNA-miRNA-mRNA 的 ceRNA 调节网络,筛选出的管家靶基因涉及 miR199a,miR199b,miR34a,miR223 与 miR7018,miR7118等等,其中miR199基因簇已被大量报道与血管生成及细胞外基质的生成降解密切相关,其机制涉及纤维化经典信号通路TGF-β信号通路。由此可以推测,芪术颗粒抗肝窦毛细血管化与肝组织硬度调节之间可能存在调节关系,miR1 99及转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）信号通路可能是芪术颗粒抗肝窦毛细血管化及调节肝脏硬度的关键靶基因及信号分子。（4）芪术颗粒对肝纤维化转运代谢功能的评价研究结果显示:①本研究采用小动物活体近红外光声成像技术对芪术颗粒治疗后小鼠肝脏进行ICG转运代谢实时检测,结果显示正常组小鼠在第90s即可达到ICG吸收值高峰;而模型组小鼠ICG吸收值达到最高峰的时间为300s左右,较正常组明显降低,同时模型组ICG代谢速度较正常组明显降低;阳性药物水飞蓟宾组及芪术颗粒低剂量组、芪术颗粒高剂量组ICG吸收高峰值时间为200s左右,较模型组ICG吸收率显著提高,但是水飞蓟宾组的ICG水平较正常组降低与模型组一致,而芪术颗粒低剂量及高剂量组的代谢率较模型组明显增快;芪术颗粒中剂量组ICG吸收高峰值时间为300s左右,但仍较模型组升高,ICG吸收与代谢曲线几乎与模型组一致。综合以上结果可见,芪术颗粒提高了小鼠肝脏吸收及代谢ICG的能力,显著改善肝脏功能。②血清分子标志物如转氨酶等生化指标虽对肝纤维化的诊断不具备特异性,但是可在一定程度上反映肝细胞损伤程度及肝细胞功能。血清谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase,GOT又称AST）和谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase,GPT又称ALT）指标检测结果显示,芪术颗粒显著降低肝纤维化小鼠血清AST和ALT水平,提示芪术颗粒的改善肝功能作用。2.细胞实验结果（1）不同硬度2D水凝胶基底构建并提取小鼠原代LSECs培养:①聚丙烯酰胺水凝胶设置0.7Kpa、4Kpa、10Kpa三个梯度分别模拟健康、肝纤维化进展期和肝纤维化后期/早期肝硬化小鼠的肝脏硬度,硬度参数根据动物实验AFM对各组肝组织的杨氏模量检测结果设定,利用拉伸仪对水凝胶进行表征显示硬度梯度建立成功;②成功提取C57BL/6J小鼠原代LSECs,对提取的C57BL/6J小鼠原代LSECs进行表面特异性分子荧光标记及电镜扫描窗孔鉴定,结果显示原代内皮细胞呈现特异性CD14分子,细胞表面呈现典型窗孔及成簇窗孔组成的筛板结构。（2）不同基底硬度对LSECs毛细血管化的影响作用研究结果:①对不同硬度基底细胞生长形态的光镜观察结果显示,水凝胶软基底（0.7Kpa）培养的LSECs呈圆形或椭圆形,细胞间相互连接较少,鲜有伪足生成,细胞膜表面窗孔数量较多;中等硬度基底（4Kpa）培养的LSECs在细胞整体形态及骨架状态上细胞铺展面积较0.7Kpa增大,伪足逐渐生成,细胞间连接增多,细胞膜表面窗孔数量较0.7Kpa减少;硬基底（10Kpa）上培养的LSECs在细胞整体形态及骨架状态已基本与盖玻片（Cov）上生长状态相同,伪足增多且增长,细胞间相互形成紧密连接,细胞骨架纤维增粗明显。②荧光检测结果显示,随着基底硬度的增加,CD31表达逐渐升高,细胞骨架纤维逐渐增粗且清晰可见,随着基底硬度的增高肝窦内皮细胞出现血管化改变。综合以上结果,提示基底硬度的改变对LSECs毛细血管化转变产生影响。（3）基质硬度调控LSECs窗孔的机械力传导机制初步探索结果显示:Ca2+载体A23187成功诱导软基底（0.7Kpa）LSECs的NO释放,平均荧光强度变化率为1.65%,而中等硬度（4Kpa）及高硬度（10Kpa）和盖玻片（Cov）基底上的平均荧光强度变化率分别为-3.3%、-4.05%、-4.83%,即Ca2+载体A23187未成功诱导NO释放,且随着检测时间延长NO荧光信号逐渐减弱,结果提示在中等硬度及以上硬度基底的LSECs失去正常释放NO的能力。结合文献报道Ca2+、eNOS与调节LSECs窗孔骨架及NO释放具有密切相关性,可以推测基质硬度调控LSECs窗孔的机械力传导机制可能与Ca2+信号引发LSECs内NO依赖途径有关。实验结论芪术颗粒具有抗肝窦毛细血管化及调节肝组织硬度的双重作用;同时,芪术颗粒对肝脏硬度的调节可通过机械力传导进一步发挥抗肝窦毛细血管化的生物力药理作用,其作用机制可能与基质硬度刺激Ca2+信号引发LSECs内NO依赖途径调节细胞骨架及窗孔结构有关。