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目的探究在人源性U87胶质瘤细胞系中是否有干细胞的存在,并对其生长状态和形态学的变化进行查看,进而探究生物钟基因Period2(Per2)的节律性。方法(1)细胞分离、提取与鉴定(1)应用悬浮培养的方式和添加bFGF、rhEGF、B27、N2到不含血清的培养基中来培养胶质瘤U87细胞,通过倒置相差显微镜查看分离、培养获得的肿瘤球形态及生长性状;应用免疫荧光染色对干细胞肿瘤球进行表面蛋白的鉴定;应用RT-qPCR检测干细胞肿瘤球表面蛋白的mRNA表达量。(2)用含血清的完全培养基(DMEM:胎牛血清:青链霉素=1:10%:1%)对干细胞肿瘤球进行分化诱导培养,并用免疫荧光细胞染色鉴定分化诱导细胞的表型,进而判定干细胞肿瘤球的多向分化能力。(2)生物钟基因Per2的节律性应用含10%血清的DMEM和添加营养因子的无血清的干细胞培养基分别培养U87细胞和U87干细胞肿瘤球,然后在培养基中加入PMA诱导剂,诱导其产生生物钟基因的表达,进而选取不同的时间点4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h的细胞,用实时荧光定量PCR检测Per2基因在两种细胞中的节律性。结果1.在有10%血清的完全培养液中人源性U87胶质瘤细胞呈现出贴壁生长的状态并有突触伸出,细胞形状多样多变。2.在不含血清的DMEM/F12中添加bFGF、rhEGF、B27、N2培养细胞,细胞悬浮态球样生长,并能不断的繁殖传代。3.细胞免疫荧光染色检测发现:培养所获得的肿瘤球细胞其表面蛋白CD133、Nestin、Sox2染色呈阳性结果。4.实时荧光定量PCR法检测发现:肿瘤球中表面蛋白CD133、Nestin、Sox2的mRNA表达明显高于U87细胞。5.用含血清的完全培养基对U87肿瘤球进行诱导分化,可重新分化成贴壁细胞,随后对其进行细胞免疫荧光染色发现:GFAP阳性细胞、β-tubllin阳性细胞、MBP阳性细胞。6.生物钟基因Per2在U87细胞和U87肿瘤球中RT-qPCR法检测发现:Per2的节律性在这两种细胞中都是12h,Per2在U87胶质瘤细胞中表达高峰是在12h、24h,谷值是在8h、20h,其中最高点是在24h,最低点是在20h。Per2在U87肿瘤球中的表达高峰是在4h、16h,谷值是在12h、24h,其中最高点是在4h,最低点是在24h。结论1.U87细胞可在含营养因子不含血清的DMEM/F12培养液中分离得到肿瘤球干细胞,并且这种干细胞表现出了较强的自我繁殖传代能力和分化成多种细胞的能力。2.Per2基因在胶质瘤U87细胞和U87胶质瘤肿瘤球干细胞中的表达节律都为12h,但在峰值与谷值之间存在差异性。