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我国已进入老龄化社会,人口老龄化的快速发展导致医疗及社会保险等问题日益突出。衰老与多种慢性疾病密切相关,如癌症、糖尿病、帕金森病、痴呆、急性冠状动脉综合征、白内障等。虽然衰老不可以避免,但适当的方法可延缓衰老,深入研究衰老机制及探讨新的抗衰老靶点及措施具有重要意义。自噬是一种进化上保守的分解代谢过程,它介导真核细胞中长寿蛋白和功能失调或多余以及受损细胞器的降解,自噬的调控在细胞的质量控制中起着重要的作用。越来越多的研究表明,自噬与衰老密切相关。WI-38细胞是二倍体成纤维细胞,来源于人胚肺组织,有着有限的传代次数,是公认的用来研究衰老的模型。本论文以D-半乳糖诱导WI-38(PDL30-40)细胞衰老,以建立D-半乳糖诱导细胞衰老模型,并在此基础上探讨诱导衰老的分子机制并寻找潜在的抗衰老靶点。采用MTT法测定不同浓度D-半乳糖(0,1.25,2.5,5,10,20g/L)对WI-38细胞活力的影响;SA-β-Gal染色检测不同浓度D-半乳糖(0,1.25,2.5,5,10 g/L)连续处理WI-38细胞14d后衰老状况;Western Blot法检测细胞周期抑制蛋白P21和P16和衰老标志蛋白β-gal的表达;DCFH-DA法测定不同浓度D-半乳糖对WI-38细胞总ROS水平的影响;Western Blot检测抗氧化酶、自噬标记蛋白和自噬相关通路蛋白表达。在D-半乳糖诱导细胞衰老模型上,采用不同浓度Mito Q进行干预,DCFH-DA法进一步测定细胞总ROS,SA-β-Gal染色检测衰老状况,Western Blot进一步检测衰老相关蛋白、抗氧化蛋白以及自噬标记蛋白表达,MDC法检测自噬。主要研究结果如下:1、D-半乳糖诱导WI-38细胞衰老模型的建立(1)D-半乳糖对WI-38细胞活力具有一定的抑制作用,并且随着浓度的增高而下降。(2)D-半乳糖可诱导WI-38细胞衰老;不同浓度D-半乳糖作用14d后,SA-β-Gal染色细胞阳性率随着浓度的增加而增高,在5g/L浓度时达到最高。(3)不同浓度D-半乳糖处理14d,P21、P16和β-gal表达随着D-半乳糖浓度的增加而逐渐增高,P16和β-gal表达在5g/L浓度达到最高。2、D-半乳糖诱导WI-38细胞衰老机制研究(1)不同浓度D-半乳糖作用WI-38细胞24h,细胞总ROS随着浓度的增加而增高,并且在5g/L浓度及后续浓度处具有显著差异性。(2)不同浓度D-半乳糖连续处理WI-38细胞14d后,抗氧化酶SOD2、SOD1和CAT的表达随着D-半乳糖浓度的增高而降低,并且与对照组比较SOD2,SOD1,GPX1和CAT在5g/L浓度处均显著降低(3)不同浓度D-半乳糖连续处理WI-38细胞14d后,在5g/L浓度处自噬标记蛋白LC3II水平降低,P62水平增高,同时自噬通路蛋白P-AMPKα(Thr172),P-ULK1(Ser555),P-ULK1(Ser757)蛋白水平降低,P-m TOR(Ser2448)和P-m TOR(Ser2481)水平增高,以上这些变化与细胞衰老呈现一定的相关性。(4)Mito Q可抑制D-半乳糖诱导WI-38细胞产生的ROS。(5)Mito Q干预后与诱导衰老组比较抗氧化酶SOD2,SOD1,GPX1和CAT表达增高。(6)Mito Q干预后与诱导衰老组比较自噬水平升高,自噬标记蛋白LC3II水平显著增高,与此同时P62水平显著降低。MDC结果显示诱导衰老组与对照组比较荧光强度显著降低,而Mito Q干预后荧光强度明显增强。(7)Mito Q干预后可降低衰老程度。连续处理14d SA-β-Gal结果显示,与诱导衰老组比较,Mito Q干预后细胞阳性率显著降低。Western Blot进一步显示Mito Q干预后P21,P16和β-gal表达,与衰老组比较表达均显著降低。结果表明,D-半乳糖对WI-38细胞具有一定的抑制作用,D-半乳糖可诱导WI-38细胞衰老,在本实验条件下5g/L D-半乳糖连续处理14d为诱导WI-38细胞衰老的最佳条件。D-半乳糖处理WI-38细胞引起ROS水平增高,抗氧化酶表达降低,自噬水平降低,其中AMPK-ULK1通路和m TOR-ULK1通路可能在D-半乳糖诱导衰老的过程中起着一定的作用。线粒体靶向抗氧化剂Mito Q可以有效地降低ROS,提高抗氧化活性,提高自噬水平,发挥抗衰老作用。