论文部分内容阅读
作为性腺发育研究的重要动物模型,家禽提供了更直观、方便的研究途径。其中,家禽原始生殖细胞(primordial germ cell, PGC)的体外培养和调控的成功,为胚胎生殖细胞系的建立和保存,以及转基因家禽的研究提供了坚实的基础。然而,家禽PGC外源性调控的稳定性和产量仍需提高,以保证相关研究的顺利进行。维甲酸(retinoic acid, RA)作为维生素A的代谢产物,在哺乳动物生殖发育中的作用被逐渐发现,对多种细胞的增殖和细胞间粘附有着重要的调节作用。本实验以艾维因鸡胚为材料,分离出胚胎期PGC,经过原代和传代培养,对不同生长状态的细胞进行多能性指标的检测和观察,探讨了RA对PGC体外增殖和细胞间粘附的影响,以及部分胞内信号转导的机制。1.鸡胚PGC原代和传代培养模型的建立取培养至4d的鸡胚,在体视显微镜下用玻璃针取其生殖嵴,用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化组织,得到的细胞在含5%胎牛血清的DMEM培养液中进行原代培养。培养液中添加了10ng/ml干细胞生长因子、10ng/ml白血病抑制因子、10ng/ml碱性成纤维生长因子、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、0.1mmol/L MEM非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素。对原代和传代后形成的细胞集落进行过碘酸雪夫氏反应(PAS)、SSEA-1和SSEA-3免疫细胞化学检测,同时利用RT-PCR检测干细胞多能性基因PouV、Nanog和Sox2的表达,均证实所形成的细胞集落是PGC。上述实验结果表明：PGC-体细胞原代及传代于饲养层培养的模型可以作为PGC增殖活性调节的研究。2.鸡胚PGC在体内和体外培养时的形态取孵化至5d的鸡胚,在体视显微镜下取出生殖嵴,经4%多聚甲醛固定,经常规脱水浸蜡,石蜡包埋,切片烤片后,进行SSEA-1免疫组化荧光染色,定位PGC及其存在状态。经证实大量PGC存在于生殖嵴中,以单个或多个粘附的形式存在,同时证明了体内PGC的多能性。体外培养的PGC经定点观察其生长状况,确定PGC集落的形成过程。另外,在不同时间阶段经观察和SSEA-1免疫细胞荧光染色,以确定PGC集落生长的状况。结果显示：不同数量PGC的集落均有SSEA-1的表达。3.维甲酸对鸡胚PGC增殖的调控利用已建立的PGC培养模型,探讨了RA对体外培养的鸡胚PGC增殖的调节作用。在传代培养PGC的培养液中添加RA以及PKC信号途径的抑制剂H7分别或联合处理细胞,在不同时间点检测PGC的多能性基因的表达。通过PAS染色,观察并统计PGC集落的数量和面积的变化。同时,通过RT-PCR检测细胞周期蛋白基因CCND1和CCNE1、周期蛋白依赖性激酶CDK6和CDK2的表达,以确定RA相关通路对细胞增殖的影响。PAS染色统计,10-7-10-5mol/LRA对体外培养PGC的数量和集落面积有明显的提高效应(P<0.05)；同时能显著促进相关检细胞周期调控基因的表达。其中,10-6mol/LRA的效果最为明显。而在与H7联合处理组中,RA的效应明显减弱。此结果表明,RA (10-7-10-5mol/L)可促进鸡胚PGC的增殖,其中10-6mol/L浓度的RA作用效果最为明显,此效应可被10-6mol/L的H7所抑制。4.RA对鸡胚PGC胞间粘附的影响利用已建立的PGC培养模型,探讨RA对体外培养的鸡胚PGC胞间粘附的调节作用。在传代培养PGC的培养液中添加RA以及PKC信号途径的抑制剂H7分别或联合处理细胞。通过特定浓度的消化液消化PGC细胞团,并统计其集落数与单个细胞数,以计算其粘附系数。通过RT-PCR检测不同处理条件下粘附蛋白钙粘蛋白(E-钙粘蛋白)和连锁蛋白(α-和β-连锁蛋白)mRNA表达的变化。粘附系数的统计结果显示：10-7-10-5mol/LRA明显降PGC间的粘附系数(P<0.05),表明PGC胞间粘附性增强；同时能够明显促进E-钙粘蛋白、α-连锁蛋白和β-连锁蛋白的表达。而在H7联合处理组中,RA的效应明显减弱。此结果表明：RA(10-7-10-5mol/L)可促进鸡胚PGC的胞间粘附,其中以10-6mol/L浓度RA的作用效果最为明显,此效应可被10-6mol/L的H7所抑制。以上实验结果表明：经SSEA-1鉴定,鸡胚生殖嵴内的PGC以单个或少量聚合的形式存在。从鸡胚生殖嵴分离的PGC原代和传代培养后,经PAS染色、SSEA-1和SSEA-3免疫细胞化学染色,及多能性基因PouV、Nanog和Sox2的RT-PCR检测,证实所培养的PGC具有干细胞的多能性。定点观察PGC的体外生长情况的结果证明,在培养的初期PGC集落的形成方式主要是聚集；之后主要是PGC集落细胞的自身分裂增殖。对体外培养不同时期PGC的SSEA-1染色说明多个PGC倾向以细胞间粘附的形式生长。在此模型的基础上,通过细胞集落数量和面积的统计,以及细胞周期调控基因CCND1/CDK6、CCNE1/CDK2 mRNA的表达变化结果说明,10-7-10-5mol/L的RA能促进鸡胚PGC的有丝分裂,从而促进其增殖。同时,PKC途径的抑制剂H7可减弱RA的促增殖作用。另外,通过粘附系数的统计,以及粘附蛋白基因表达变化检测表明,10-7-10-5mol/L的RA可增强PGC的胞间粘附。同时,PKC途径的抑制剂H7能够明显减弱RA的促粘附作用。以上结果提示,RA可能通过PKC信号途径促进鸡胚PGC的增殖和胞间粘附。这些结果有助于鸡胚PGC增殖调控的研究,并有利于PGC的体外大量扩增,为嵌合体和转基因家禽的制备提供实验平台。