第一章 电离(磁)辐射对人肝癌细胞株BEL-7402 的实验研究 研究目的：1.观察高能X线对人肝癌细胞株BEL-7402的作用，探讨其抑制细胞生长的机制。2.研究极低频磁场联合X线对人肝癌细胞株BEL-7402的作用机理。3.观察β、γ辐射药物131I-17-AAG的体外/体内抗人肝癌细胞株BEL-7402的作用机制。 研究方法：1.人肝癌细胞系BEL-7402，以不同剂量高能X线照射（2、4、6、8、10Gy）。作细胞集落形成试验：扫描电镜观察超微结构改变。流式细胞仪研究细胞凋亡、细胞周期的改变：基因芯片研究细胞凋亡机制；WESTERN BLOT检测野生型P53蛋白水平。2.人肝癌细胞株BEL-7402用不同X线照射（0，2，4，6，8，10Gy）后，极低频磁场处理（100Hz，0.7mT，30分钟，3天）。利用扫描电镜作形态观察，流式细胞仪，基因芯片研究细胞凋亡机制。3.由17－AAG与Na131I以过氧化氢法合成靶向药物131I－17－AAG。作细胞生长抑制曲线和细胞周期的分布研究。BEL－7402植入裸鼠皮下，肿瘤形成后，131I－17－AAG试剂通过尾静脉注入、研究肿瘤体积改变。Western-blot研究Akt2表达变化。 研究结果：1.细胞集落形成试验结果显示，单纯高能X线组在辐射（2、4、6、8、10Gy）时的细胞抑制率为（38％、41％、20％、24％和30％）。扫描电镜观察到凋亡细胞。流式细胞仪检测5种不同放射强度下，单纯放射组凋亡率为0.10％、8.10％、0.10％、0.41％和2.20％，4Gy照射时凋亡最为明显，与未辐射对照组比较差异有统计学意义（F=6.9，P＝0.03）。基因芯片结果发现：高能X线组与未照射组基因表达强度相比，共有1045条基因出现上调，946条基因出现下调。其中比值≥2倍的基因共有167，上调97条，下调70条。与凋亡相关基因共80条，上调基因65条，下调基因15条。高能X线细胞生长停滞于G2/M期，细胞周期停滞相关的野生型P53蛋白表达水平均显著增高。2.极低频磁场联合X线组扫描电镜形态显示，肝癌细胞株BEL－7402发生凋亡改变。流式细胞仪观察结果显示，当X线剂量是2，4，6，8.10Gy，极低频磁场联合X线凋亡率为10％，14.5％，4.3％，5.1％，7.01％。基因芯片结果显示，极低频磁场联合X线组共有1465条出现上调，1108条出现下调。其中比值≥2倍的基因共有336条，上调262条，下调74条。与凋亡相关基因共110条，上调基因71条，下调基因39条。涉及CDC25、ATM、P38、PTEN、P53、G1/S、FAS、G2/M、Cell Cycle、Apoptosis、CASPASE基因通路中的基因。极低频磁场加X线组差异表达结果中有13条同时出现在极低频磁场组。42条同时出现在X线组。3.131I-17-AAG的标记率为83％，纯为96.6％，比活度为1.48×105MBq/μmol。在4℃生理盐水中的131I-17-AAG可以保持120h的稳定。用药物治疗48h后，在DMSO、Na131I、17-AAG、131I-17-AAG组，流式细胞术检测sub-G峰是（2.54±0.11）％、（6.52±1.01）％、（12.97±1.33）％、20.57±1.23）％。荷瘤裸鼠尾静脉注射相应试剂后，每4d记录各组肿瘤体积。9d后测量肿瘤体积显示，131I-17-AAG，22.2 MBq组与131I-17-AAG，11.1MBq组比较有统计学意义（F=26.17，P<0.001）；131I-17-AAG，33.3 MBq组与131I-17-AAG，22.2 MBq组比较无统计学意义（F=3.11，P=0.034）。32d后测量肿瘤体积显示，131-17-AAG组与对照组间比较有统计学意义DMSO group（F=24.18，P<0.001），131I group（F=20.68，P<0.001）。而且131I-17-AAG组与17-AAG组比较有统计学意义（F=13.11，P=0.034）。在131I-17-AAG组Akt2的表达，显著地低于DMSO、131I组。 研究结论：1.高能X线能诱导人肝癌BEL-7402细胞产生凋亡。4Gy照射时最为明显。抑制癌细胞增殖作用的机制与G2/M期停滞有关。其中野生型P53激活是引起细胞周期停滞重要原因。2.极低频磁场与X线通过不同的基因通路影响细胞凋亡。极低频磁场与X线对人肝癌细胞株BEL-7402凋亡有协同作运用。3.131I-17-AAG通过β、γ辐射与靶向联合作用能有效地抑制BEL-7402肿瘤细胞生长。131I-17-AAG是一种有可能成为的治疗BEL-7402细胞瘤的药物。 第二章 肝癌调强放射治疗的临床研究 研究目的：1.检验同期整合补量调强SIB-IMRT（Simultaneously Integrated Boosting，SIB and Intensity modulation radiotherapy，IMRT）给量方法治疗计划的剂量分布误差，探索SIB-IMRT的质量保证的措施和方法。2.利用自主呼吸控制技术，对肝内病变分区后，探讨肝脏呼吸运动的一致性问题。用于指导临床实践。3.利用自主呼吸控制技术，SIB-IMRT技术治疗原发性肝癌，探讨肝癌放射治疗的疗效与副作用。 研究方法：1.用水模移植治疗计划的方法，在Varian放射治疗计划系统上建立三种SIB-IMRT模拟模型：SIB-IMRT标准模拟模型、非对称偏心GTV与CTV模型、CTV内含危险器官（organ at risk，OAR）模犁，设定统一调强优化参数，完成IMRT治疗计划，获得靶区剂量分布特征。利用DVH推算和验证由于SIB方式可能造成的计划剂量分布误差，剂量梯度误差。利用适形度指数，剂量均匀度指数，验证IMRT治疗计划剂量分布误着的存在与一般规律。2.介入治疗后的肝内肿瘤患者16例，在自主呼吸控制技术（ABC）屏气时间内完成一次肝脏CT扫描。注入造影剂，做第二次CT扫描，完成一名患者的数据收集。将CT图像传入PROWESS治疗计划系统。肝脏分为4区，腹腔干为原点，以肝内浓集的碘油为研究对象。在PROWESS治疗计划系统内，测定三次CT图像中碘油相对原点的三维坐标。计算三维移动值，用SPSS8.0统计，单向方筹分析，LSD多重比较。研究肝随呼吸运动的一致性。3.中晚期肝内肿瘤患者16例，运用Varian公司呼吸控制技术（ABC）在屏气时间内完成肝脏CT扫描。将CT图像传入Eclips7.0治疗计划系统。在Varian的ABC呼吸门控系统下控制呼吸，运用Varian23EX加速器，以SIB-IMRT方式完成放射治疗。评价疗效，副作用。 研究结果：1.调强计划系统可以建立合理的SIB-IMRT模型。非对称偏心GTV与CTV相交区可以满足SIBIMRT计划要求，但远心区CTV无法满足要求。CTV剂量遗漏为18.46％。含OAR模型中，GTV、CTV剂量分布皆无法满足要求，CTV剂量遗漏为75.65％。剂量梯度变化在OAR周围变化最大，最大梯度值为12％/mm。三组适形度指数，剂革均匀度指数明显不同。2.肝内不同位置病变随呼吸运动在X轴、Y轴、Z轴方向的位移值为2.16mm、2.74 mm、7.19 mm，标准差为1.6mm，1.7 mm，and4.3 mm三者之间有显著性差异，Z轴相对与X轴、Y轴呼吸运动位移值最明显，Y轴次之，X轴最小。（F=9.193，ρ值=0.000）。1，2，3，4区中4区X轴移动值较其它区的ρ值为0.075。在呼吸运动控制下，限制X轴、Y轴运动的同时，将Z轴超过3mm范围由81％降低至28％。3.呼吸控制放疗时，肝脏位置在一次放疗中（intrafraction）和分次放疗间（interfraction）的重复性如下：在头脚方向上的分别为1.5 mm和6.6 mm；在前后方向上分别为0.8 mm和4.2 mm：在左右方向上分别为0.5 mm和5.3mm。治疗后3个月复查，CR0例，PR10例，NR5例，PD1例。有效率（CR+PR）为62.5％（10/16）。有效的10例中总照射剂晕≥50 Gy者9例。甲胎蛋白值14例有不同程度的降低。中位生存时间8个月，1年生存率分别为12.5％。转氨酶升高6例。诱发心脏缺血3例。 研究结论：1.用水模移植计划模型方法能有效检验SIB-IMRT计划的剂量分布误差，可作为每种调强治疗计划前的剂量验证方法。同时本模型可能成为评价各种放疗计划系统性能的一种质量控制方式。2.肝内不同位置病变（1，2，3，4区）随呼吸运动何移值（mm）在X轴、Y轴、Z轴方向的移动值无显著性差异，表明肝内病变随呼吸运动具有一致性。Z轴相对与X轴、Y轴呼吸运动位移值有显著性差异。（F=9.193，ρ值＝0.000）。3.运用呼吸控制、SIB-IMRT技术，给予不同分割2.0～2.5Gy/次（肿瘤直径<3CM），5次/周；2.5～3.0Gy/次（肿瘤直径3-10CM），3～4次/周。总剂量45.5～60.5Gy，患者可以耐受。近期有效，无严重的并发症。PET可能成为有效的生物疗效观测方法。