研究背景半个多世纪以来,经络生物学内涵研究一直是中医科研攻关的核心问题。国内外学者借助生物、物理、影像学等现代方法在此领域开展了大量的研究,以期证实经络存在,揭示经络实质。其中,经络客观显示是经络现代科学研究的重要内容之一,为证明经络存在提供了实验证据。但是,目前,大部分的经络可视化研究方法在生物安全性、组织定位标记、重复推广方面存在一定缺陷,限制了对已显示循经轨迹的结构和功能等关键问题的深入研究;无法科学地解释已显示循经轨迹的生物学实质。因此,探寻客观显示经络轨迹的新技术方法,揭示循经轨迹的生物学特征,在此研究方向仍有诸多工作亟待开展。近年来,结缔组织、组织液与经络相关的认知逐渐被学界关注和接受。有研究者提出“循经低流阻通道”说,创建了透明鱼组织液通道客观显示法、小型猪经络不通病理模型,开展了一系列研究验证,取得一定进展。但是,受动物模型、实验条件和统计学方法等诸多因素限制,进一步开展循经低流阻通道结构和物质基础研究困难较大。因此,探索一种适用于循经低流阻通道研究的理想动物模型,创建循经低流阻通道显示技术,继续推进循经低流阻通道的生物物理特性研究,将有助于推动经络生物学内涵的研究。目的和意义本研究在前期循经低流阻通道研究的基础上,创建大鼠皮下组织低流阻检测技术,采用特殊染料示踪法进行大鼠皮下循经低流阻通道显示,探索一种适用于循经低流阻通道研究的新动物模型及方法;观察皮下示踪轨迹的分布特征及其与传统经络循行路线的相关性;了解示踪轨迹组织的形态特征;同时,研究示踪轨迹与旁开非经组织的差异蛋白质表达,从差异蛋白组学角度探讨循经低流阻通道的物质基础和生物学功能;为解释循经低流阻通道的生物学机制提供新证据,以期为揭示经络生物学内涵的研究开拓新方向。研究方法第一部分研究:大鼠循经低流阻点的检测1.用57-6F30经络定位仪检测大鼠皮肤督/任脉循行线上的低电阻点。2.用生物流阻/组织液压测量法检测大鼠体表背/腹部中段、横跨督/任脉循行线皮下组织的流阻,分析循经低电阻点与旁开高电阻点皮下组织的流阻值差异,创建大鼠皮下低流阻检测方法。第二部分研究:大鼠循经低流阻点注射阿尔新蓝溶液的迁移特征观察1.在23例大鼠督脉、任脉循行线背/腹部中段皮下的低流阻点注射阿尔新蓝(Alcianblue,AB)溶液,比较不同注射时间、注射剂量、观察时间下的AB迁移特征,筛选AB注射参数。2.使用生物流阻/组织液压测定仪测量5例大鼠循经低流阻点AB注射前后的组织液压,分析注射前后局部组织液压变化。3.在大鼠督脉(10例)、任脉(27例)低流阻点注射AB,观察注射48h后AB的分布特征,比较AB迁移线与传统经络循行线的位置关系;统计AB迁移线的方向、长度、宽度和出现率;并与皮下高流阻点注射AB液(督/任脉各8例)、循经低流阻点注射墨汁(督/任脉各5例)进行比较,分析AB循经迁移的规律。第三部分研究:大鼠循经AB迁移线的形态特征观察运用新鲜组织冰冻切片和多种复合染色方法,观察大鼠AB循经迁移线的组织结构特征,比较其与周围组织的差异;观察AB循经迁移组织与血管、神经和肥大细胞(mastcell,MC)的关系;分析AB循经迁移组织的形态特征与经络功能的相关性。第四部分研究:大鼠循任脉AB迁移线与旁开结缔组织的差异蛋白组学研究运用液质联用技术(AB Sciex5600+TripleTOF平台)并在数据依赖性采集模式下,分析鉴定大鼠沿任脉循行的皮下AB迁移线组织和旁开非经结缔组织的蛋白质组;采用SWATH MSALL非标及定量方式对二者进行差异蛋白质组学分析;通过对二者差异蛋白进行GO、KEGG、PPI、BP link KEGG分析,了解差异蛋白质的功能及其参与的生物学过程;结合传统经络理论和现代经络研究结果,分析筛选与经络功能相关性最高的差异蛋白质;并用Western-blot检测被筛选出的蛋白质的表达水平。研究结果第一部分研究:1.确定大鼠循经皮下低流阻检测的关键参数:穿刺悬拉被测皮肤四角呈水平面固定,5#带侧孔针头,针头侧孔生理盐水流速为10滴/min。2.督脉、任脉循行线皮下低流阻点的检出率基本一致,分别为72.0%和73.3%。大鼠督脉循行线皮下低流阻点的流阻值为7.99±1.88(× 106,dyne·s·cm-5),旁开高流阻点(低电阻点连线垂直旁开0.5～1cm)的流阻值为10.63±1.51(×106,dyne·s·cm-5)(n=9);大鼠任脉循行线皮下低流阻点的流阻值为10.37±1.26(× 106,dyne·s·cm-5),旁开高流阻点(低电阻点连线垂直旁开0.5～1cm)的流阻值19.13±1.37(×106,dyne·s·cm-5)(n=12);循经线上皮下低流阻点的流阻值极显著低于旁开高流阻点(P<0.01)。第二部分研究:1.确定皮下循经低流阻点注射AB的参数:液量0.2mL、注射时间10min,观察时间注射48h后。2.AB注射结束后局部组织液压比注射前升高了 2.52mmHg。3.大鼠循督脉皮下低流阻点注射AB 48h后,在背部皮下结缔组织层出现沿督脉、膀胱经循行分布的迁移线,出现率为80%。其中,向头迁移较多,沿督脉循行的迁移轨迹最长。以注射点为界,AB迁移长度为1.1～4.7cm,平均长度2.74±0.36cm;以AB扩散区的边缘为界,AB迁移线长度为0.3～1.4cm,平均长度0.78±0.12cm;平均宽度为0.125±0.02cm。循任脉皮下低流阻点注射AB 48h后,在腹部皮下结缔组织层出现沿任脉、胃经、肾经循行分布的迁移线,出现率为81%。其中,向尾迁移较多,沿脾经循行的迁移轨迹最长;以注射点为界,AB迁移长度为0.4～4.9cm,平均长度2.12±1.96cm;以AB扩散区的边缘为界,AB迁移线的长度为0.3～4.1cm,平均长度1.12±0.42cm;平均宽度为0.15±0.07cm。AB迁移规律与古典经络循行特征相似。在非低流阻点注射AB液、低流阻点注射墨汁均未出现循经的线状迁移。第三部分研究:1.大鼠沿任脉循行的AB迁移线存在皮下疏松结缔组织层,其两侧与周围组织边界清晰,主要为胶原纤维、弹性纤维以及嵌合在纤维成分中的酸性粘多糖交错连接形成一定空隙的网状通道。出现AB迁移线的皮下结缔组织层的间隙大于周围组织。2.在迁移线组织中分布着丰富的MC,以及血管和胆碱能神经。第四部分研究:1.在大鼠沿任脉循行的AB迁移组织与非经线结缔组织中有468个蛋白差异表达。GO分析结果显示,差异蛋白质主要分布在细胞质、胞外外泌体、囊泡、胞外囊泡、胞内细胞器,以及细胞膜或细胞器内膜结构上;其分子功能可能为同种蛋白结合、辅酶结合、酶结合、核苷结合、细胞粘附分子结合、蛋白复合物结合、氧化还原酶激活、谷胱甘肽氧化物酶激活;参与的生物学过程主要为代谢过程,也参与了对激素的响应,对机械损伤的响应等。KEGG分析结果显示,差异蛋白质主要参与的代谢通路为代谢、细胞过程、疾病形成的生物学过程等。2.将以上数据与经络理论和以往经络实质研究的结果结合,初步分析认为:在皮下结缔组织中,沿任脉循行的AB迁移线组织中3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、ATP 合酶亚基 ε(ATP synthase subunit epsilon,ATP5E)、电压依赖性 Ca2+通道亚基 α 2/δ 1(Voltage-dependent calcium channel subunit alpha-2/delta-1,CACNA2D1)、谷胱甘肽过氧化物酶3(Glutathione peroxidase 3,Gpx-3)差异表达。3.Western-blot结果显示,循任脉的AB迁移线中GAPDH、ATP5E和CACNA2D1的表达水平显著高于旁开非经组织(p<0.05),AB迁移线中Gpx-3的表达水平高于旁开的组织,差异接近显著(P=0.08)。结论1.本研究成功建立了大鼠皮下流阻检测方法,发现大鼠督脉、任脉皮下的流阻值显著低于非经区域,提示大鼠皮下存在循经低流阻通道。2.建立了大鼠循经低流阻点注射AB的循经低流阻通道显示方法,观察到在皮下结缔组织层可出现与古典经络体表循行特征相似的AB循经迁移线。3.大鼠皮下AB循经迁移线中有较大的间隙空间和丰富的MC、血管、胆碱能神经分布,为解释循经低流阻通道的生物物理特性提供了形态学证据。4.在大鼠循任脉的AB迁移线与旁开非经结缔组织中有468个差异表达的蛋白,迁移线中上调表达的ATP5E,CACNA2D1,GAPDH和Gpx-3参与的生物学过程与经络现象和针灸效应密切相关,这4种蛋白可能是大鼠任脉循经低流阻通道组织中的特征性物质。本研究为解释循经低流阻通道的生物学机制提供了新证据。