目的:通过免疫组化,研究ATF4基因与膀胱癌分期的关联。进一步利用CRISPR/cas9技术构建ATF4基因敲除的膀胱癌细胞(T24)株,研究ATF4基因对膀胱癌细胞生物学行为的影响。方法:(1)利用免疫组化对61例分期不同的膀胱癌组织进行染色,研究分期不同的膀胱癌组织中ATF4的表达情况。(2)利用CRISPR/cas9技术,针对ATF4两个外显子区,设计两对gRNA,通过BbsI酶对PX459载体质粒进行酶切,将gRNA链接到PX459载体质粒上,将构建好的PX459-ATF4-gRNA载体质粒通过脂质体转染进T24细胞中,对ATF4两个外显子区进行敲除。并通过PCR,琼脂糖凝胶电泳,测序和Western-blot对敲除效果进行验证。(3)利用Transwell实验来检测T24细胞在ATF4基因被敲除后,迁移和侵袭能力是否发生变化。通过克隆形成实验来检测敲除前后T24细胞克隆形成的能力。结果:(1)在免疫组化实验中我们发现,膀胱癌组织分期越高,ATF4的表达就越高。(2)通过PCR琼脂糖凝胶电泳及测序显示gRNA成功插入到PX459载体质粒中,对转染PX459-ATF4-gRNA载体质粒的T24细胞,通过PCR琼脂糖凝胶电泳,发现目的条带变短并与预期结果相同,测序也显示序列变短,Western-blot清楚地显示ATF4基因完全敲除,这些结果说明成功构建了ATF4基因稳定敲除的T24细胞。(3)对ATF4基因敲除的细胞实验发现,ATF4基因表达沉默抑制了T24细胞克隆形成能力(P<0.05),并且T24细胞迁移和侵袭的能力降低(P<0.05)。结论:(1)膀胱癌分期越高,ATF4基因的表达越高。(2)成功构建了稳定敲出ATF4基因的T24膀胱癌细胞。(3)敲除ATF4基因会使T24细胞的克隆形成,迁移和侵袭能力降低(P<0.05)。