地衣芽孢杆菌发酵条件优化及抑菌蛋白的分离提取

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地衣芽孢杆菌属于革兰氏阳性细菌,广泛分布于自然界,是芽孢杆菌中极具发展前景的菌种之一。它可产生具有抗菌活性的抑菌物质,如:抗菌蛋白、几丁质酶、多肽物质等。地衣芽孢杆菌可抑制多种植物病原菌的生长,特别是对植物的真菌性病害具有良好的拮抗作用。目前,将其开发为高效生物农药,已成为当今国内外研究的热点。因此,设法提高其活菌数并探索抑菌机理对其产品质量的保证具有重要意义,同时也为开发该菌株在农业方面的应用奠定了一定的基础。  本文以Bacillus licheniformis CGMCC6155菌株为研究对象,以提高其活菌数为目的,对菌株发酵条件进行了优化,并对其发酵液的抑菌机制进行了初步探索,为开发成高效生物农药提供了新的理论依据。首先对该菌株进行了生理生化特征分析及16S rDNA鉴定,将其命名为Bacillus licheniformis CGMCC6155。在前期研究的基础上,创新性地探索了不同的活性保护剂对该菌的影响。结果表明:无论在发酵的哪个生长阶段加入保护剂,海藻糖的活性保护效果最佳。在发酵初期添加海藻糖能在160天后使细胞存活率达到69.8%,其最佳添加浓度为0.6 g/L。其次,利用单因素试验考察了该菌株的3L发酵罐培养条件。实验结果表明:地衣芽孢杆菌的最佳发酵条件为:通气速率2.0 vvm,搅拌转速350 r/min,接种量8%,发酵温度36℃。在上述最优发酵条件下,通过控制发酵pH为7.5,在发酵16h后补糖,并控制发酵体系葡萄糖的浓度在4~5 g/L时,发酵效果最为理想。最优条件下获得:菌体浓度约为40 g/L;活菌浓度为2.22×1010 cfu/mL,菌体的芽孢形成率约为90%。最后,在前期的实验基础上,对其发酵液进行了初步的研究。利用硫酸铵分级沉淀法对该发酵液进行盐析,初步提取纯化活性抗菌物质,探讨了该抗菌物质的基本性质,并进一步探索了其抑菌机理。  本研究表明:⑴当硫酸铵的饱和度为35%时盐析出来的抗菌蛋白的抑菌活性最强。该物质对棉花枯萎病病菌、番茄叶霉病、番茄灰霉病和番茄枯萎病4种病原菌均表现出显著的抑菌能力。⑵分别考察了温度、蛋白酶及pH对该抗性物质抑菌能力的影响。结果表明:提取的抗菌物质具有良好的热稳定性;对蛋白酶K不敏感,对胃蛋白酶和胰蛋白酶部分敏感;当pH为4.0~5.0时基本无抑菌能力;当pH为6.0~10.0时,pH7.0时蛋白的抑菌活性最强;同时,抗菌蛋白的抑菌的能力随着pH(大于7.0)的升高而降低。⑶将盐析得到的粗提物经过Sephadex G-100柱层析系统进行纯化,可以分离得到两个吸收峰(A和B)。经检测发现:只有吸收峰B具有显著的抑菌效果。因此,选择吸收峰B下的收集液进一步经SDS-PAGE检测可知:其蛋白大小为32.0 kDa左右。⑷在含有抑菌蛋白的PDA培养基内,当蛋白浓度达到100~150μg/mL时,其对菌丝的抑制率达到76.71%~84.93%。在含有抑菌蛋白的PDA培养液内,当蛋白浓度达到100~150μg/mL时,其对菌丝的抑制率达到75.65%~82.46%。⑸通过探索该抗菌物质的抑菌机理的研究可发现:抗菌蛋白能致使病原菌的菌丝成团发黑、溶菌等现象;菌丝形态部分出现畸形、泡状膨大结构、菌丝瘦弱等现象;菌丝的细胞透性增加以及内含物外渗的现象。
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