链状亚历山大藻microRNA高通量测序及生物信息学分析

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microRNA (Micro ribonucleic acids, miRNAs)是真核生物中普遍存在的一类长约19-25 nt的内源性非编码小RNA,能够在转录后水平调控靶基因的表达。作为一类表达具有时序性和组织特异性的进化上相对保守的调节者,microRNA在生物体的许多生理代谢过程中都发挥着重要的调节作用,如细胞增殖、器官发育、信号转导和响应胁迫等。赤潮是一种全球性的生态异常现象和自然灾害,给人类生产、生活和生态环境都来了严重的损害。随着海洋环境污染的逐渐加重,赤潮的发生次数、危害面积及带来的损害越来越大,因此,全球的研究者都为赤潮的发生机理和防治付出了很多的努力。甲藻是一类重要的赤潮生物,研究者已在生理生态方面对甲藻做了很多研究,但赤潮生物爆发性增殖的分子机理研究的相对较少。链状亚历山大藻是一种全球分布的能产生麻痹性贝毒毒素的典型甲藻,本文利用高通量测序技术对该藻延迟期和对数期两个文库进行了测序,共得到38,092,056和32,969,156条raw reads,发现88个已知的microRNA,可归为32个家族,得到15个新颖的microRNA以及83个microRNA前体。其中在两个不同的生长时期有12差异表达的microRNA。通过12个差异表达microRNA的靶基因预测,我们共得到了1813个靶基因,并对其进行了GO注释和KEGG功能注释。osa-miR2876、rgl-miR5139、aca-miR-3p-456915和ae-miR159a均参与DNA复制或细胞快速生长代谢相关的途径的调控,如:细胞周期,嘌呤、嘧啶的代谢,错配修复等。同时rgl-miR5139与藻细胞的吞噬作用相关,也为甲藻的兼性营养能力提供了证据。此外,从链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)延迟期、对数期两个小RNA文库中选择了四个差异表达的与该藻快速生长调控相关的microRNA (osa-miR2876、rgl-miR5139、aca-miR-3p-456915和ae-miR159a),设计f/2培养下延迟期、对数期和高氮、高磷、高锰对数期五个条件,以5.8srRNA为内参基因,以SYBR Green I为荧光染料,用加尾法荧光定量PCR对其相对表达量进行了检测。结果表明:osa-miR2876、rgl-miR5139、aca-miR456915-3p均在延迟期有最高的表达量,osa-miR2876、rgl-miR5139在延迟期的表达量显著高于f/2对数期和诱导对数期,与高通量测序结果是一致的;aca-miR456915-3p在延迟期的表达量与f/2对数期的表达量相当,高通量测序得到的延迟期的表达量是对数期的1.21倍,实验结果与测序结果基本一致。tae-miR159a在对数期及诱导对数期的表达量均显著高于延迟期,这与测序结果是一致的。通过对microRNA数据中得到的与该藻生长调控相关的四个microRNA进行克隆测序,确定了序列信息的正确性。并通过设置不同的培养条件,对其表达进行分析,进一步证明了microRNA在甲藻中的表达以及在链状亚历山大藻中的调控作用,也为赤潮甲藻爆发性增殖的分子机理研究奠定了基础。
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