DNA磷硫酰化（PT）是首次发现在磷酸核糖骨架上的一类特殊生理修饰,它以序列特异性和Rp立体构型方式将磷酸二酯键中的非桥连氧原子替换成硫原子,广泛地分布于各种属微生物中。其核酸酶抗性以及PT硫原子的还原性和亲核性在PT修饰菌中发挥了多元化的生理作用,包括形成限制-修饰（R-M）防御屏障、表观遗传调控、环境适应性以及细胞氧化还原稳态的维持等。PT修饰的生理丰度受到严谨的调控,其生物合成涉及Dnd ABCDE五个蛋白:Dnd ACDE催化DNA骨架上的氧-硫替换反应;DndB则是dnd BCDE操纵子的阻遏蛋白,能特异性结合dnd BCDE基因簇上游的启动子区域,进而阻碍dnd CDE及其自身基因的转录,实现对胞内PT水平的负向调控。然而DndB对启动子的阻遏作用是否受到某些未知环境或细胞刺激物（效应物）的调节,其潜在应答以调控PT修饰的信号分子及相关作用机制依然未知。鉴于此,本论文首先从氨基酸序列分析入手,发现了DndB蛋白内一个严格保守的五肽基序DGQHR;定点突变评估显示,DGQHR基序对DndB的PT调控功能至关重要,但却并不直接参与其与启动子的相互结合,这支持并指向了由效应物介导的DndB调控方式。随后在蛋白质同源结构建模及相关序列保守性分析引导下,鉴定了DndB蛋白的ATPase酶活性（～32 nmol Pi/min/mg）;并且由DGQHR基序突变引起的PT频率变动,正是源自该五肽位点对DndB蛋白ATPase活性的影响。接下来凭借酶动力学测定、凝胶电泳阻滞实验（EMSA）以及蛋白质寡聚状态分析（BN-PAGE）等多种手段,揭示了DndB的ATPase属性在PT严谨性调控中所起到的关键性作用机制:DndB阻遏蛋白识别ATP分子作为诱导效应物,ATP的结合能改变DndB构象而干扰阻遏蛋白与启动子的互作,促使DndB-ATP从启动子DNA上解离下来,因而起始dnd BCDE基因簇的转录;ATP水解活性则将结合着ATP的阻遏蛋白重置到无效应物附加的空载状态,恢复DndB的DNA结合构象及其与启动子的互作,从而重新抑制了dnd BCDE操纵子的表达。最后,砷酸盐、博来霉素处理下的生理学实验也进一步揭示了DndB蛋白能灵敏地感应细胞内ATP水平的上升或者下降,相应地实时上调或者下调PT修饰系统的表达。综上所述,DndB阻遏蛋白是一个ATP传感器——能对ATP的胞内水平作直接应答,它以一种自我调节和可重复利用的独特方式操控着dnd BCDE基因簇的转录及由此带来的PT修饰变化。本研究阐明了由阻遏蛋白DndB的ATPase活性介导了PT修饰的严谨性调控机制。一方面,DndB通过感应细胞的ATP水平来相应调节全基因组被修饰的频率,这种ATP应答型方式为耗能的PT硫原子掺入过程提供了一种十分经济且精细的调控,在DNA表观遗传修饰系统中尚属第一例报道。另一方面,本工作所揭示的DndB自调节性和可重复利用性特点,确保了细菌内的Dnd修饰蛋白和PT水平能受到严谨的控制,为PT系统形成限制-修饰（R-M）防御屏障并广泛水平基因转移提供了理论支持。再者,PT修饰系统的这种ATP应答型严谨调控,还帮助其适应自身的其他多元化生理功能。据报道,ATP的胞内浓度在微生物经历生长周期的不同时相或面临各种环境压力（UV辐射、博来霉素、无机砷、生长温度/渗透压/p H剧变）时均会发生明显改变。结合本成果,这些特定的ATP浓度变化,理论上都将被DndB感应以调节dnd BCDE基因的表达并可能相应改变PT修饰的胞内丰度,从而确保适量的PT修饰能够发挥其在细菌环境适应性、氧化还原稳态维持等多方面的生理作用。因此,本论文中DndB以自调节性和可重复利用性特点对基因组PT修饰所实行的ATP感应型严谨调控机制,也为后续PT生物学意义的探究指明了新的方向。本论文的另外一部分工作,通过GST Pull-down技术系统地分析了pf0-1菌PT修饰蛋白质之间的相互作用,并创造性地采用蛋白共表达纯化的方法获得了天然的Dnd CDE蛋白复合物,为PT修饰的生化机制解析、体外重建及定向生物合成奠定了基础。