研究目的针对微流控芯片光刻制作工艺中存在的过程繁琐，实验条件要求高、设备成本高等问题，本研究采用激光雕刻机在双面粘性薄膜上雕刻流体通道，以聚二甲基硅氧烷（PDMS）为盖片、双面粘性薄膜（DSA）为流体通道层、玻璃为基片，以研制一种低成本、易制作、便携式的PDMS-DSA微流控芯片，并应用于循环肿瘤细胞的捕获富集及食品中大肠埃希菌O157:H7的检测。研究方法1、研制简易型微流控芯片检测系统：采用计算机辅助软件（Pro/Engineer5.0, ProE5.0）设计简易型微流控芯片CAD图形，采用激光雕刻技术在双面粘性薄膜上按照设计图形切出流体通道，再将激光雕刻后的双面粘性薄膜与PDMS及玻片封接制成PDMS-DSA微流控芯片，将制备好的微流控芯片与注射泵、注射器、荧光倒置显微镜和CCD等设备连接，建立自动化的简易型微流控芯片反应系统。2、简易型微流控芯片的表面修饰和抗体固定方法的优化：以巯基-马来酰亚胺基团硅烷化偶联法为芯片的表面修饰方法，以链霉亲和素-生物素亲合法为芯片的抗体固定方法，通过比较不同反应时间、进样流速等实验参数，优化出简易型微流控芯片中抗体的最佳反应条件。3、简易型微流控芯片在循环肿瘤细胞捕获富集中的应用：以简易型微流控芯片检测系统为平台，以乳腺肿瘤细胞（ATCC MCF-7和MDAMB231肿瘤细胞）为研究对象，在最佳抗体固定条件下，通过比较不同进样流速、抗体浓度及反应时间，建立基于简易型微流控芯片的循环肿瘤细胞捕获富集方法，并将此方法应用于模拟肿瘤患者外周血样本的检测。4、简易型微流控芯片在大肠埃希菌O157:H7检测中的应用：以简易型微流控芯片检测系统为平台，以最佳抗体固定参数固定抗体，在此基础上，以免疫荧光技术为检测手段，优化最佳进样流速、检测时间，建立基于简易型微流控芯片大肠埃希菌O157:H7检测方法，并将此方法应用于牛奶及饮用水模拟污染样本中大肠埃希菌O157:H7的检测。研究结果1、使用激光雕刻机可在1分钟内同时雕刻8-10个双面粘性薄膜，并在1分钟完成简易型微流控芯片的制作，整个制作过程中无需使用超净间、光刻机和有机溶剂。以此芯片与荧光倒置显微镜检测器和CCD连接，成功搭建了低成本、自动化的简易型微流控芯片检测系统。2、在进样流速为2μl/min时，未经表面修饰直接通入生物素标记的EpCAM抗体的芯片对MCF-7肿瘤细胞的捕获率为3%，而经过表面修饰再通入生物素标记的EpCAM抗体的芯片对MCF-7肿瘤细胞的捕获效果明显更高，为(92±3)%。3、在EpCAM抗体浓度为10mg/ml，反应时间为1h，进样流速分别为2μl/min、4μl/min、6μl/min和8μl/min时，基于简易型微流控芯片系统对MCF-7肿瘤细胞的捕获率分别为(92±3)%、(60±2)%、(24±2)%和(10±2)%，对MDAMB231肿瘤细胞的捕获率分别为(75±3)%、(52±2)%、(20±3)%和(7±2)%。可见，两种肿瘤细胞在进样流速为2μl/min时捕获率最高。将此方法应用于模拟肿瘤患者外周血样本的检测，在进样流速为2μl/min、4μl/min、6μl/min和8μl/min时，基于简易型微流控芯片系统对肿瘤细胞的捕获率分别为(88±3)%、(50±2)%、(17±3)%和(5±2)%。4、在抗大肠杆菌O157:H7FITC标记抗体浓度为50mg/ml，反应时间为30min，双面粘性薄膜厚度为25μm，进样流速为2μl/min，总检测量为60μl，总检测时间为30min时，基于简易型微流芯片系统对大肠埃希菌O157:H7捕获率为(95±2)%，与大肠埃希菌ATCC25922和伤寒沙门菌无交叉反应。将此方法应用于牛奶和饮用水模拟样本大肠埃希菌O157:H7的检测，灵敏度分别为86%和93%，特异度均为100%。结论1、基于激光雕刻技术的简易型微流控芯片制作工艺具有流程简单，对实验仪器要求低，成本低，低碳环保等优点，弥补了传统光刻工艺复杂繁琐的不足。基于简易型微流控芯片检测系统可实现自动化、智能化的流体操作。2、在最佳反应条件下，经过巯基-马来酰亚胺基团硅烷化偶联法进行表面修饰的简易型微流控芯片对细胞的捕获率比未经表面修饰的简易型微流控芯片捕获率高。3、以简易型微流控芯片检测系统捕获循环肿瘤细胞，进样流速为2μl/min时的细胞捕获率明显比8μl/min时高，且随着流体速度的不断加快，细胞的捕获率随之下降。与其他细胞捕获方法相比，此方法具有捕获率高、成本低等优点，对临床早期、快速诊断疾病具有一定的价值。4、成功构建了简易型微流控芯片大肠埃希菌O157:H7检测系统，与常规细菌检测方法相比，此方法具有较高的灵敏度和特异度，且成本低，自动化程度高等优点，具有一定的实际应用价值。