Sansanmycin (SS)是一组尿苷肽类抗生素,由我国贵州土壤中发现的链霉菌Streptomyces sp. SS所产生。 Sansanmyc in对铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa,结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis及多重耐药结核分枝杆菌具有很好的抑制作用。此类抗生素家族还包括pacidamycin, napsamycin 和 mureidomycin等。这类化合物结构中含有一种非蛋白质氨基酸,即间位酪氨酸(m-Tyr),在自然界中极少存在。pacidamycin, napsamycin, sansanmycin的生物合成基因簇均已被克隆,对pacX基因功能研究显示其为一种新的苯丙氨酸羟化酶,负责催化苯丙氨酸(Phe)羟化形成肽链骨架中的m-Tyr。通过生物信息学分析,发现sansanmycin基因簇中的ssaX基因与pacX基因和npsK基因有高度的同源性,有可能负责sansanmycin肽链骨架中m-Tyr的合成。本研究以Streptomyces sp. SS基因组为DNA模板扩增ss aX基因,利用带His标签的表达质粒pETl6b成功构建了重组蛋白表达质粒pET16b-ssaX,并转化E. coli BL21(DE3),获得了表达His10-SsaX蛋白的重组菌林。初步优化了His10-SsaX蛋白可溶性表达的发酵条件,即重组菌株在LB培养基,37℃培养至OD600=0.6,以0.02mM IPTG于16℃诱导24 h。初步优化了菌体蛋白中Hisio-SsaX亲和层析纯化条件,采用含200 mM咪唑的蛋白洗脱液将结合在柱子上的目的蛋白Hisio-SsaX进行洗脱。最终每升LB发酵液获得SsaX蛋白粗品9.9 mg, SDS-PAGE电泳结果显示,蛋白粗品纯度达到61.7%。建立了体外酶促反应体系,采用HPLC荧光检测终产物的生成,确证重组蛋白SsaX能够催化Phe生成m-Tyr,反应中也有少量对位酪氨酸(p-Tyr)生成,SsaX蛋白的催化产物p-Tyr:m-Tyr约为1：8。综上,本研究利用大肠杆菌异源表达并纯化了SsaX重组蛋白,确证了sansanmycin生物合成基因簇中基因ssaX的功能为苯丙氨酸3-羟化酶,可催化苯丙氨酸间位的羟化反应,形成m-Tyr。本工作不仅为m-Tyr的合成提供了一种新方法,而且为通过遗传操作进行sansanmycin结构改造以获得更多抗菌活性更高的衍生物奠定了理论基础。