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背景与目的胶质母细胞瘤是最常见的颅内恶性肿瘤,是星形细胞肿瘤中侵袭能力最强的类型,胶质母细胞瘤患者预后很差,即使给予手术治疗并辅以放疗和化疗,病人的中位生存期仍然小于1年。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是一种新型二代口服烷化剂,对胶质母细胞瘤有显著的抗肿瘤作用,沙利度胺(thalidomide,THD)是一种谷氨酸衍生物,其具体作用机制尚不完全清楚,一般认为THD可通过抑制整合素ανβ3、ανβ5的表达以及血管内皮生长因子等介导的生血管作用来抑制肿瘤细胞对间质的黏附与血管生成。THD能增强TMZ对恶性胶质瘤的治疗作用。本实验主要研究THD、TMZ以及THD与TMZ联合应用对胶质瘤细胞ανβ3整合素受体表达、黏附、迁移与侵袭的影响,进而探讨THD增强TMZ对恶性胶质瘤治疗作用的潜在机理。方法①制备胶质瘤来源的细胞外基质,并在铺被有细胞外基质的培养皿中分别以加入THD(100μg/ml)、TMZ(100μM)以及THD+TMZ(100μg/ml+100μM)的培养液培养人胶质瘤细胞系LN229细胞,对照组加入等体积溶媒(DMSO)。在倒置显微镜下观察细胞的贴壁过程及形态变化。②检测各组LN229细胞表达整合素ανβ3的阳性率和平均荧光强度(meanfluorescence intensities,MFI)首先用磺酰罗丹明B(SRB)比色法分别测定各组悬浮细胞的存活率。各组细胞培养4h后取悬浮细胞,并用0.25%胰酶消化贴壁细胞,充分悬浮细胞。取细胞(1×10~4)200g离心5min,弃上清。用含1%牛血清白蛋白的PBS洗涤2遍后加异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人整合素ανβ3抗体及其同型对照,于4℃孵育45min,PBS再次洗涤,用流式细胞仪检测。获得阳性细胞比例以及MFI值。③检测各组细胞黏附于细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的能力将LN229细胞以5×10~4/ml的密度接种于铺被有同种细胞来源的ECM的96孔培养板,培养基内含有THD、TMZ、THD+TMZ以及等量溶媒,培养60分钟。轻轻吸出细胞悬液,用预温的PBS洗三次,除去未黏附细胞。每孔加入10%戊二醛100μl固定30分钟,0.1%结晶紫染色细胞后在酶标仪上测定595nm波长处的光密度(OD)值。④评价各组LN229细胞侵袭与迁移能力建立Transwell小室模型与划痕损伤模型,观察各组体外培养的LN229胶质瘤细胞穿过基质胶的数量与细胞迁移的距离,并以此反映各组药物对细胞侵袭与迁移能力的影响。结果①溶媒对照组与TMZ单药组大多数LN229细胞迅速形成伪足并与其他细胞接触形成单细胞层。THD和TMZ联合组有大量LN229细胞呈游离状态,贴壁细胞的伪足短仍保持类圆形。②THD与TMZ对细胞整合素ανβ3表达的影响SRB法检测悬浮细胞的存活率,对照组及TMZ组悬浮细胞很少,故忽略不计。THD组悬浮细胞OD值为0.216,联合组悬浮细胞OD值为0.209,两组悬浮细胞生存率分别为93.5%,90.5%。各组悬浮细胞生存率都在90%以上。流式细胞计检测显示THD组和联合组LN229整合素ανβ3表达减弱,其中贴壁细胞整合素ανβ3的阳性表达率分别为对照组的81.8%与77.9%,平均荧光强度(MFI)分别为对照组的66.8%、53.7%;悬浮细胞整合素ανβ3阳性表达率更低,分别为对照组的63.7%、55.0%,MFI分别为对照组的49.8%、54.1%。而TMZ组ανβ3阳性表达率为对照组的103.3%,MFI为对照组的90.4%。③THD与TMZ对LN229细胞黏附于细胞外基质的作用THD组与联合组培养皿孔内剩余的结晶紫染色的细胞明显少于对照组和TMZ组(P均<0.05),THD组与联合组之间无差别,TMZ组与对照组间也无差异(P>0.05)。THD,TMZ,THD+TMZ组细胞黏附抑制率分别为25.23%、0.88%、26.83%。④THD与TMZ对LN229细胞侵袭及迁移能力的影响侵袭实验中THD组与THD+TMZ组平均每视野侵袭细胞数目小于TMZ组与对照组(P均<0.05),但THD组与联合组两组间无差异(P>0.05)。细胞划痕试验中THD组与THD+TMZ组细胞与对照组相比迁移距离缩短(P<0.05),THD组与联合组间无差异(P>0.05)。TMZ组对照组间无差异(P>0.05)。结论THD具有影响细胞黏附于ECM的能力以及抑制细胞迁移与侵袭能力的作用,其机制可能与抑制或干扰胶质瘤细胞ανβ3整合素受体的表达有关。替莫唑胺对胶质瘤细胞ανβ3整合素受体的表达、细胞黏附、迁移及侵袭能力没有影响。沙利度胺与替莫唑胺联合应用在抑制整合素表达进而抑制瘤细胞迁移与侵袭方面并未发现有协同作用。