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目的:心房颤动(atrial fibrillation,AF)是高血压心脏病、缺血性心脏病以及瓣膜性心脏病的并发症之一,目前治疗难度较高,发病率也有不断升高的趋势。心房颤动的发生机制非常复杂,一直是心血管疾病研究的重点。心房颤动多伴随心肌纤维化,而关于心肌纤维化的发病机理尚不明确,也有一些学者进行了很多的研究,并取得了一定有价值的结论,阐明心肌纤维化发生发展的潜在分子机制,可为心房颤动的研究和治疗提供一定的支持和帮助作用。心脏受到损伤或者负荷增加之后,出现正常的心肌细胞被非功能性的纤维化组织所代替,从而导致不同程度的心脏功能障碍,其中的关键所在就是心肌成纤维细胞的生物学功能变化。在表观遗传学中,像DNA甲基化、组蛋白修饰、微小RNA也会参与心肌成纤维细胞的生物学功能变化的机制。尤其是DNA甲基化修饰,作为DNA甲基化催化酶之一的DNMT3A,其表达的变化对心肌纤维化的发生进程可能也起着非常重要的作用。因此,通过恢复表观遗传上的转变来纠正或者抑制心肌纤维化的进展,理论上是可行的。由于DNA甲基化改变引起的表观遗传变化,进而介导修饰微小RNA表达可能对转录和转录后基因表达有显著的影响,从而可能会参与心肌纤维化过程。但是,有关微小RNA和心肌成纤维细胞自噬关系的研究目前所知甚少。微小RNA可以通过对基因表达的调节而作为生物标记物。考虑到自噬存在于心脏成纤维细胞和纤维化过程中,我们提出假设表观遗传修饰可通过影响自噬来阻止心肌纤维化。微小RNA是心肌纤维化复杂的生物过程中的重要调控因子,尽管如此,微小RNA是如何调控自噬和心肌纤维化过程的,目前仍知之甚少。我们设计本研究旨在探明miR-200b在心肌成纤维细胞自噬中的表达情况及潜在的功能和调控作用机制。同时也对DNA甲基化调节微小RNA的表达进行研究。最近有关研究表明,微小RNA的启动子区异常的DNA甲基化参与到了心肌纤维化疾病的病理过程中。发现在纤维化的心肌成纤维细胞中,有异常DNA甲基化出现。DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)是甲基转移酶家族的成员之一,其启动子特异位点甲基化会导致基因表达沉默。本实验意在探明DNMT3A对miR-200b在心肌纤维化和心肌成纤维细胞自噬中的调控作用,这些研究结果可能会有助于开发新的治疗房颤心肌纤维化的有效方法。方法:选取2016年1月~2017年12月于我院心脏外科施行心脏瓣膜置换术(二尖瓣/主动脉瓣置换)的风湿性心脏病患者。排除合并高血压、糖尿病、冠心病、肥厚性心肌病和慢性肾功能不全的患者,排除相关临床资料不完整,以及一月内出现明显感染症状的患者。按有无合并房颤分为房颤(AF)组和窦性心律(SR)组,分别在手术中获取各组的心肌组织标本。将心肌组织标本进行石蜡病理切片、免疫组化染色、心肌组织RNA的提取及定量、定量qRT-PCR检测miR-200b的表达以及Western Blotting检测离体心肌组织标本中DNMT3A相对表达水平。复制SD大鼠心肌纤维化模型,采用随机抽号的方法将40只SD大鼠分成两组,一组为实验组即腹主动脉狭窄组,另一组为空白对照组即假手术组。腹主动脉狭窄组大鼠按照Hertig描述的方法进行腹主动脉缩窄手术,假手术组不进行腹主动脉缩窄手术。所有处理均在术后24小时开始,为期4周。4周后,这些动物被处死,取出心脏标本。把取出的心脏标本进行细胞培养和药物处理后进行组织学分析,包括石蜡病理切片、HE染色和Masson染色法观察大鼠心肌组织中心肌纤维化的程度和胶原容积分数(CVF);通过qRT-PCR检测miRNA-200b、DNMT3A和U6在inhibitors和miRNA-200b mimics及其阴性对照组中的表达水平;Western blotting法测定DNMT3A以及P62蛋白在SD大鼠心脏样本中表达水平的变化;通过MTT比色法检测观察inhibitors和microRNA-200b mimics对心肌成纤维细胞活化增殖的影响。通过细胞转染和大鼠DNMT3A的小干扰RNA(siRNA)寡聚体阴性对照观察自噬小体数量及细胞自噬溶酶体数量,检测细胞内自噬相关基因水平和蛋白质表达水平。采用吖啶橙(AO)染色法测定自噬过程。结果:DNMT3A与miR-200b在房颤心肌重构中的表达变化研究结果:SR与AF两组结果比较:DNMT3A在AF组心肌组织中阳性表达率明显高于SR组(P<0.05);Col1A1在AF组心肌组织中阳性表达率明显高于SR组(P<0.05)。qRT-PCR实验结果显示:SR组与AF组相比较,AF组心肌重构组织中miR-200b表达水平显著降低,差异有统计学意义(p<0.05);与SR组相比,AF组心肌重构组织中的DNMT3A mRNA表达明显增加,差异有统计学意义;与SR组相比,AF组心肌重构组织中的Col1A1 mRNA表达明显增加,差异有统计学意义。Western blotting实验结果显示:与SR组相比,AF组心肌重构组织中的DNMT3A蛋白表达明显增加,差异有统计学意义;与SR组相比,AF组心肌重构组织中的Col1A1蛋白表达明显增加,差异有统计学意义。DNMT3A甲基化修饰miR-200b调控心肌成纤维细胞自噬的分子作用机制研究结果:HE染色结果显示:AAC组中的心肌组织间质中出现了较明显的胶原纤维,比Sham组增生明显。AAC组与Sham组相比较,心肌排列紊乱、心肌细胞肥大;Masson染色结果显示:AAC组纤维化程度更为严重、心肌间质胶原容积分数(CVF)增加明显;qRT-PCR实验结果显示AAC组与Sham组相比较,心脏组织样本中miR-200b表达水平显著降低,差异有统计学意义(p<0.05);与Sham组相比,AAC组的DNMT3A和Col1A1 mRNA表达明显增加,差异有统计学意义;Western blotting实验方法测定证实,与Sham组比较,DNMT3A蛋白表达在AAC中显著增加,AAC组P62蛋白较Sham组明显降低。免疫组织化学染色进一步证实与假手术组相比,AAC组DNMT3A蛋白表达显著增加,而P62蛋白明显下降。qRT-PCR实验发现在雷帕霉素诱导的心肌成纤维细胞自噬中,miR-200b显著降低,但DNMT3A mRNA明显升高。Western blotting检测发现,雷帕霉素诱导的心肌成纤维细胞自噬中DNMT3A蛋白升高。雷帕霉素处理48小时后LC3BII/I比值明显升高,但P62表达下降。吖啶橙染色显示:用雷帕霉素处理与未经处理的心肌成纤维细胞相比,在心肌成纤维细胞中诱导了更明显的红色斑点荧光。结论:在房颤心肌纤维化发生发展过程中,DNMT3A表达增高,而miR-200b表达降低;瞬时转染DNMT3A-siRNA,可以使miR-200b表达上调,进而抑制心肌成纤维细自噬发生;DNMT3A甲基化修饰miR-200b调控心肌成纤维细胞自噬在房颤心肌重构中发挥重要作用。我们的研究结果也为DNMT3A和miR-200b与雷帕霉素联合,提高心肌成纤维细胞自噬活性的分子机制提供了基础。我们发现miR-200b通过抑制雷帕霉素诱导自噬过程,减缓心脏纤维化过程。目前的研究工作为miR-200b抗房颤纤维化的分子机制提供了理论证据。