砷化物是一种广泛存在于环境中的人类确定致癌物,其存在形式主要有两种,分别是砷酸盐和亚砷酸盐,其中最主要的存在形式为亚砷酸钠（NaAs02）。有报道显示,长期暴露于砷化物会导致多种疾病,在砷污染地区肝癌的发病率显著增高,威胁当地居民的生命健康。砷化物致癌机制有众多假说,目前诸多研究显示,自噬和EMT与NaAs02所致人肝细胞癌的发生发展密切相关,其具体作用过程和分子机制还有待进一步探讨。自噬是一种重要分解代谢机制,在真核细胞中可以起到维持细胞稳态的作用。自噬功能紊乱是肿瘤发生发展的重要因素之一。上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）参与了多种病理生理过程,在肿瘤的发生发展中也发挥了重要的作用。长期暴露于砷化物会导致细胞自噬水平出现紊乱,无法正常分解代谢有害组分,导致细胞内EMT转录因子累积,促进EMT过程的发生,进而引起细胞发生恶性转化。有研究报道miRNAs通过调控下游信号通路参与了 NaAs02引起的自噬过程。miR-21是最早发现的致癌miRNAs之一,在本课题组前期研究中,在NaAs02处理多种细胞中均高表达,其中包括人正常肝细胞（L-02）。而miR-21参与NaAsO₂所致自噬的分子机制和自噬及EMT在肝细胞恶性转化中的调控作用尚未报道。目的运用多种分子生物学方法探讨NaAs02处理对miR-21的影响及miR-21对自噬的调控作用,并进一步研究自噬和EMT在NaAsO₂所致肝细胞恶性转化中的作用及其部分分子机制,从而为进一步研究砷化物致癌机制的分子机制和发现砷化物致肝癌的分子标志提供科学线索。方法一、亚砷酸钠急性处理对L-02细胞自噬水平的影响用 0.0、1.0、2.0、4.0 或 8.0 μM NaAsO₂ 分别处理 L-02 细胞 24 h,或分别用0.0或2.0μM NaAsO₂分别急性处理肝L-02细胞0、3、6、12或24h后,或分别用 2.0μM NaAsO₂ 或 100 nM 的 Rapamycin 处理 L-02 细胞 24 h 后,Western blot检测细胞mTOR、beclin 1和LC3 II/I蛋白水平,免疫荧光实验检测细胞LC3表达水平,用透射电镜检测细胞自噬体数目。以观察NaAs02对L-02细胞自噬水平的影响。二、ERK通路在亚砷酸钠所致L-02细胞自噬激活中的作用用0.0、1.0、2.0、4.0或8.0 μM NaAsO₂分别处理L-02细胞24 h,或分别用0.0或2.0 μM NaAsO₂分别急性处理肝L-02细胞0、3、6、12或24 h后,或用10μM MEK/ERK 抑制剂 U0126 处理 L-02 细胞 3 h 后,再用 0.0 或 2.0μM NaAs02处理 L-02 细胞 24 h,Western blot 检测细胞 p-ERK、ERK、PTEN、mTOR、beclin 1和LC3Ⅱ/Ⅰ水平。以观察ERK通路在NaAso2所致L-02自噬激活中的作用。三、亚砷酸钠对L-02细胞miR-21水平和其靶蛋白的影响分别用0.0、1.0、2.0、4.0或8.0μMNaAsO₂分别处理L-02细胞24h,或分别用0.0或2.0 μM NaAsO₂分别急性处理L-02细胞0、3、6、12或24 h后,qRT-PCR检测细胞miR-21水平,Western blot检测细胞PTEN、PDCD4和Spry 1蛋白水平。以观察NaAs02对于L-02细胞miR-21水平和其靶蛋白表达水平的影响。四、miR-21在亚砷酸钠所致L-02细胞自噬激活中的作用分别用100 nM anti-miR-21和anti-miR-nc转染L-02细胞,然后分别暴露于0.0 或 2.0μM NaAs02 同样处理 24 h,qRT-PCR 检测细胞 miR-21 水平,Western blot检测细胞PTEN、ERK、beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ和mTOR水平。以观察下调miR-21对PTEN、ERK及自噬相关蛋白水平的影响。五、上调PTEN对亚砷酸钠急性处理L-02细胞ERK及自噬相关蛋白的影响用pCDNA-PTEN和pCDNA质粒转染L-02细胞24 h,然后用暴露于0.0或2.0μMNaAsO₂ 同样处理 24 h,Western blot 检测细胞 PTEN、p-ERK、mTOR、beclin 1和LC3 Ⅱ/Ⅰ。以观察PTEN对亚砷酸钠急性处理L-02细胞ERK及自噬相关蛋白的影响。六、miR-21通过PTEN参与亚砷酸钠所致L-02细胞ERK激活和自噬激活分别用 100 nM anti-miR-21 或 anti-miR-nc 和 25 nM PTEN siRNA 或 Con siRNA 共转染 L-02 细胞 24 h,然后再用 2.0μM NaAsO₂ 处理 24 h,Western blot检测细胞PTEN、P-ERK、ERK、mTOR、beclin1、LC3蛋白水平,用透射电镜检测L-02细胞自噬体的数量。以观察miR-21通过PTEN参与亚砷酸钠所致L-02细胞ERK激活和自噬激活的作用。七、亚砷酸钠慢性处理对L-02细胞自噬流的影响用0.0或2.0 μM NaAsO₂分别诱导L-02细胞发生恶性转化,慢性处理L-02细胞至30代后（约15 w）,得到对照L-02细胞（L-02）和砷恶转的L-02细胞（T-L-02）。Western blot检测L-02细胞和T-L-02细胞自噬相关蛋白p62、beclin 1、LC3 II/I和ATG5蛋白水平,用mRFP-GFP-LC3双标腺病毒检测自噬流水平。用100 nM的Rapamycin处理L-02细胞24 h作为阳参,然后和对照细胞及T-L-02细胞同样处理后用透射电镜观察自噬体的情况。以观察慢性处理对于L-02细胞自噬流的影响。八、亚砷酸钠慢性处理对L-02细胞EMT的影响用0.0或2.0μM NaAsO₂分别诱导L-02细胞发生恶性转化,慢性处理L-02细胞至30代后（约15 w）,得到0、10、20和30代对照L-02细胞和砷恶转的T-L-02细胞。在显微镜下观察细胞形态,用Western blot实验和免疫荧光实验检测EMT表达水平。以观察NaAsO₂对L-02细胞EMT的影响。九、调节自噬流对亚砷酸钠处理L-02细胞EMT的影响用 25 nM 的 ATG5 siRNA 或者 Con siRNA,或用 100 nM 的 Rapamycin 处理T-L-02细胞24 h,Western blot实验检测自噬相关蛋白和EMT水平,Western blot检测自噬相关蛋白和EMT指标蛋白的表达水平。以观察自噬流对NaAsO₂处理L-02细胞EMT的影响。十、p62通过Snail参与亚砷酸钠所致L-02细胞发生EMT与恶性转化用25 nM的p62 siRNA或Con siRNA处理由2.0 μM NaAsO₂慢性处理30代致恶性转化的T-L-02细胞24 h,Western blot实验和免疫荧光实验检测细胞p62、Snail、E-cadherin和vimentin的蛋白表达水平,用软琼脂集落形成实验检测细胞恶性程度,用Transwell实验检测细胞的侵袭转移能力;分别用0.0或2.0μM的NaAsO₂处理L-02细胞24 h,用Co-IP实验检测NaAsO₂处理后L-02细胞p62与Snail的结合;将L-02细胞和T-L-02细胞同样进行Co-IP实验,用Co-IP实验检测到p62蛋白与Snail蛋白的结合能力;用免疫荧光共定位方法观察T-L-02细胞Snail和p62蛋白的定位表达。以观察p62控制Snail在NaAs02所致L-02细胞EMT和恶性转化中的作用。结果一、亚砷酸钠急性处理对L-02细胞自噬水平的影响结果发现用NaAs02急性处理的L-02细胞,随着NaAsO₂剂量和时间增加,自噬相关蛋白beclin 1和LC3 Ⅱ/Ⅰ则逐渐增加;mTOR蛋白水平明显降低,具有一定的剂量-效应关系和时间效应关系;2.0 μM NaAsO₂能使得L-02细胞LC3荧光表达增加,自噬体数目增多。说明NaAsO₂能够激活L-02细胞发生自噬。二、ERK通路在亚砷酸钠所致L-02细胞自噬激活中的作用结果发现用NaAs02急性处理的L-02细胞,随着NaAsO₂浓度和时间增加,p-ERK蛋白水平随着剂量和时间增加而升高。2.0μM NaAs02处理L-02细胞相较于对照L-02细胞p-ERK、beclin 1和LC3 Ⅱ/Ⅰ水平显著增高,PTEN和mTOR水平降低;而U0126可阻滞2.0μM NaAsO₂处理所致L-02细胞这些蛋白的表达。说明U0126能够下调NaAsO₂所致的L-02细胞自噬相关蛋白升高,提示ERK参与了 NaAsO₂所致的自噬水平上调。三、亚砷酸钠对L-02细胞miR-21水平和其靶蛋白的影响结果发现用NaAsO₂急性处理的L-02细胞,随着NaAs02浓度和时间增加,miR-21水平也随之升高,而miR-21的靶蛋白PTEN、PDCD4和Spry 1蛋白水平均随着NaAsO₂剂量和时间的增加而减少,并具有一定的剂量效应和时间效应关系。说明NaAsO₂可以上调miR-21水平并抑制其靶蛋白的表达。四、miR-21在亚砷酸钠所致L-02细胞自噬激活中的作用结果发现下调miR-21可阻滞2.0 μM NaAs02处理所致miR-21、beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ和p-ERK水平升高及PTEN和mTOR水平降低。说明通过anti-miR-21下调miR-21可以阻滞NaAs02所致的L-02细胞ERK通路激活和自噬水平的升高,提示miR-21在NaAsO₂所致自噬激活中发挥重要作用。五、上调PTEN对亚砷酸钠急性处理L-02细胞ERK及自噬相关蛋白的影响结果发现高表达PTEN可显著阻滞2.0 μM NaAsO₂所致L-02细胞PTEN和mTOR降低及beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ和p-ERK水平升高。说明高表达PTEN可以抑制NaAs02所致L-02细胞ERK激活,进而激活mTOR通路,抑制自噬相关蛋白的表达,提示PTEN在NaAsO₂所致L-02细胞自噬中起到了重要调控作用。六、miR-21通过PTEN参与亚砷酸钠所致L-02细胞ERK激活和自噬激活结果发现下调miR-21可以阻滞亚砷酸钠引起的PTEN和mTOR降低及ERK和自噬相关蛋白的beclin、L3Ⅱ/Ⅰ增加,敲除PTEN后则可以逆转这个过程;anti-miR-21处理可以降低自噬体数目,而联合PTEN siRNA后可以逆转这个过程。说明下调miR-21引起的L-02细胞自噬水平降低可以被关闭PTEN所阻滞,,提示miR-21的高表达抑制PTEN和激活ERK在NaAsO₂处理L-02细胞自噬激活中发挥着重要调控作用。七、亚砷酸钠慢性处理对L-02细胞自噬流的影响结果发现T-L-02细胞beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ和ATG5表达水平升高,同时自噬底物蛋白p62在T-L-02细胞中也高表达;T-L-02细胞荧光点数明显多于L-02细胞,且T-L-02细胞的黄色荧光点和红色荧光点的比值明显低于对照细胞;T-L-02细胞的自噬体比例增加,但自噬溶酶体比例减少。说明NaAsO₂处理的T-L-02细胞自噬溶酶体生成受阻,自噬流被阻滞。八、亚砷酸钠慢性处理对L-02细胞EMT的影响结果发现2.0 μM NaAs02慢性处理30代后所致恶性转化L-02细胞,随着处理时间延长（细胞恶性程度增加）,细胞形态逐渐由圆形的上皮细胞样向长梭形间质细胞样转变,E-cadherin的蛋白表达水平逐渐降低,而间质细胞指标vimentin随着处理时间的延长而表达显著增加,EMT转录因子Snail也显著增加。说明NaAs02慢性处理诱导了 L-02细胞发生EMT。九、调节自噬流对亚砷酸钠处理L-02细胞EMT的影响结果发现通过siRNA关闭ATG5抑制了 T-L-02细胞beclin 1和LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达,但是增加了 p62的蛋白水平,阻滞了自噬流,进而引起T-L-02细胞Snail和vimentin增加,E-cadherin水平降低;Rapamycin处理引起T-L-02细胞mTOR蛋白的表达降低,进而使得beclin 1和LC3 Ⅱ/Ⅰ水平增高,而p62的表达被抑制,增强了自噬流,进而抑制了 Snail和vimentin的表达,上调了 E-cadherin的水平。说明自噬流水平在NaAs02所致L-02细胞EMT过程中发挥了关键作用。十、p62通过Snail参与亚砷酸钠所致L-02细胞发生EMT与恶性转化结果发现p62 siRNA处理关闭p62引起T-L-02细胞p62、Snail和vimentin蛋白水平和荧光强度降低,E-cadherin蛋白水平和荧光强度增加;p62siRNA处理T-L-02细胞集落形成数和细胞侵袭转移数均显著低于对照T-L-02细胞。2.0μM NaAsO₂急性处理L-02细胞和慢性处理的T-L-02细胞中均可以观察到p62和Snail蛋白的结合。说明p62通过Snail参与了 NaAsO₂所致L-02细胞EMT及恶性转化。结论1.miR-21通过靶蛋白PTEN调控ERK在NaAsO₂所致肝细胞自噬中发挥重要作用。2.NaAs02自噬流阻滞引起肝细胞p62高表达,累积了 Snail进而引起EMT,从而诱导肝细胞发生恶性转化。