肺癌是目前全球高发的癌症之一,它具有高死亡率以及预后差等特点,然而目前针对于肺癌,并没有非常有效的治疗手段。近些年,随着细胞治疗的发展,CAR-T细胞治疗的研究和临床实验也在如火如荼的进行中。CAR-T细胞治疗是将T细胞从病人外周血中分离出来,经过体外的活化后利用慢病毒,逆转录病毒或者电转染等方式对T细胞进行转染,使其能够过表达CAR序列,而后通过一系列的检测和质控,再回输入病人的体内达到靶向杀伤肿瘤的目的。在过去的一些报道和临床实验中,虽然CAR-T细胞对于血液肿瘤有着良好的杀伤效果,但是对于实体肿瘤的治疗一直效果欠佳,主要原因包括:1、肿瘤微环境是一个免疫抑制的环境,存在大量免疫抑制细胞和细胞因子;2、缺乏特异性有效的靶点。前期研究证实肺癌细胞特异性高表达LunX蛋白,且用LunX单克隆抗体S-35-8治疗肺癌小鼠模型取得了很好的疗效,那么制备针对LunX蛋白的CAR-T细胞可能对肺癌也有着很好的治疗效果。基于此,我们展开了对针对LunX抗原的CAR-T细胞研究,并取得了如下结果:1、LunX特异性CAR-T细胞的构建我们使用SPR检测了 LunX蛋白单克隆抗体S-35-8与LunX抗原蛋白的亲和力,结果显示两者有着很高的亲和力,这也为我们后续的实验提供了充分条件。接着我们设计了 CARLunX的分子序列,在5’ LTR段用信号肽序列来引导跨膜,随后使用S-35-8的单链抗体识别区序列和CD8 α铰链区,用来增加CAR分子的灵活性,为了检测整个分子的的跨膜结构,我们在胞外区加入了 c-Myc标签蛋白,在CD28分子的跨膜区后连接着4-1BB共刺激域,同时我们使用另一个启动子EF1 α来启动GFP荧光蛋白的表达,用来指征转染效率。我们分别将构建好的质粒直接进行PCR检测以及转染入293T细胞中进行RT-PCR检测,结果显示构建的CAR分子可以成功表达。接下来,为了进一步探究我们构建的CAR分子是否可以跨膜,我们将转染了 CAR分子的293T细胞进行免疫荧光的检测,我们从结果中可以看到,当293T细胞转染了 CAR序列以后,其细胞膜会大量表达C-Myc标签蛋白分子,胞内有GFP荧光蛋白的表达。以上结果说明,我们成功构建了 CARLunX质粒。2、LunX抗原可以刺激CARLunX T细胞分泌细胞因子构建好CAR质粒以后,我们包装了慢病毒,并对T细胞进行了感染,通过对GFP以及c-Myc标签蛋白的检测,结果提示T细胞已高效率过表达CAR序列。随后对过表达CAR序列的T细胞进行免疫荧光检测,我们进一步确认CAR序列在T细胞中成功跨膜表达。为了探究CARlunXT细胞与LunX抗原是否有直接的作用,我们分别在铺有LunX的培养板里加入空白对照T细胞,无关对照CARCD19T和CARlunXT细胞进行孵育,经过24小时后,我们发现只有加入CARlunXT细胞的培养上清中有高浓度的效应细胞因子IFN-γ,IL-2和TNF-α。这些表明CARlunXT细胞可以被LunX抗原直接活化,并分泌大量的效应细胞因子。3、CARlunX细胞可以靶向杀伤LunX抗原阳性的肺癌细胞我们分别用免疫荧光以及流式细胞术检测了肺癌细胞系NCI-H292,NCI-H1650,A549以及正常肺纤维细胞系HFL1表面LunX分子的表达情况,结果表明肺癌细胞系均表达LunX分子。我们使用CARlunXT细胞以及CARCD19T细胞对靶细胞进行杀伤检测,结果显示只有CARlunXT细胞才对LunX蛋白阳性的肺癌细胞系有特异性杀伤作用,而CARCD19T细胞不对肺癌细胞进行特异性的杀伤。4、LunX阳性的肺癌细胞可以特异性的活化CARlunXT细胞我们将肺癌细胞系NCI-H292,NCI-H1650以及A549分别与CARlunXT细胞和CARCD19T细胞共孵育后检测培养体系上清中效应细胞因子的浓度以及效应细胞的增殖情况,我们发现在靶细胞的刺激下,CARlunXT细胞会特异性分泌大量IFN-γ,IL-2和TNF-α,同时也会特异性的活化增殖。5、CARlunXT细胞可以抑制小鼠移植原位瘤模型的生长在之前的结果,我们已经验证了 CARlunXT细胞在体外对靶细胞有特异性杀伤作用,那么CARlunXT细胞在体内是否可以行使杀伤效应呢?于是我们构建了小鼠的移植原位瘤模型,发现经过CARlunXT细胞治疗后,小鼠相比于对照组,肿瘤的大小以及生长速率都得到了很好的抑制,与此同时,CARlunXT细胞治疗组小鼠的生存率也得到了明显的改善,为了观察CARlunXT细胞细胞在肿瘤中的浸润情况,我们对小鼠的肺脏进行了免疫荧光的检测,我们可以看到在肿瘤中有大量CARlunT细胞的浸润。由此,CARlunXT细胞可以在体内发挥特异性的杀伤功能。6、CARlunXT细胞可以抑制小鼠PDX皮下肿瘤模型的生长为了进一步接近于病人体内肿瘤的真实情况,我们选用了病人来源的肺癌组织,对小鼠进行了皮下移植,经过测量和观察,使用CARlunXT细胞治疗以后,小鼠的PDX肿瘤的大小得到了明显的移植,同时生存率也得到了提升。为了观察CARlunXT细胞在肿瘤中的浸润情况,我们对肿瘤进行了免疫荧光检测,结果显示肿瘤内部存在CARlunXT细胞的浸润。在治疗期间,我们对小鼠的体重进行了统计,与对照组相比,小鼠的体重保持在比较稳定的状态,说明CARlunXT细胞治疗在体重方面不存在副作用。所以,CARlunXT细胞可以有效治疗PDX小鼠模型。综上所述,我们构建了针对于肺癌的CARlunXT细胞,并在体外和体内对其特异性和有效性进行了验证,发现CARlunXT细胞可以对肺癌细胞在体外进行有效的杀伤,同时在小鼠模型中,CARlunXT细胞可以抑制肿瘤的生长,延长小鼠的生存率。该研究中CARlunXT细胞对于治疗肺癌实体瘤具有重要的价值。