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类病毒(viroid)是一类共价闭合环状的单链RNA,基因组大小在246-434 nt范围内,不能编码任何蛋白。到目前为止,类病毒只在高等植物(单子叶植物和双子叶植物)中被发现,其在植物上造成的症状与病毒危害的症状类似。虽然在类病毒-寄主互作方面,前人已经做了大量的研究,但是具体的互作机制尚不清晰。本研究以啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid,HSVd)/黄瓜(Cucumis sativus cv.’Suyo’)为研究系统,通过突变体接种、转录组测序以及miRNA测序等手段,研究了 HSVd-黄瓜之间的相互作用,进一步揭示了类病毒-寄主互作的机制。1.HSVd不同突变体致病性差异分析。来源于葡萄的HSVd变体HSVd-g接种啤酒花之后,经过15年的适应形成HSVd-h,HSVd-h和HSVd-g在25、26、54、193和281等5个位点存在碱基的差异,并且HSVd-h和HSVd-g在其指示寄主黄瓜上分别表现为弱毒和强毒。针对5个差异碱基,分别以HSVd-h和HSVd-g为模板,把HSVd-h中的碱基突变成HSVd-g中的碱基,反之亦然,构建突变体。HSVd-h系列5个突变体、HSVd-h及HSVd-g的致病力从强到弱的顺序为:HSVd-g>HSVd-h>HSVd-h54>HSVd-h193>HSVd-h281>HSVd-h25>HSVd-h26;HSVd-g 系列6个突变体、HSVd-h及HSVd-g的致病力从强到弱的顺序为:HSVd-g54>HSVd-g193>HSVd-g>HSVd-g281>HSVd-g(25-26)>HSVd-g25>HSVd-g26>HSVd-h。由此可知,HSVd 的 25 和26位碱基改变后,其致病力与亲本相比差异较大,而54、193和281位碱基改变之后,其致病力与亲本相比差异较小。因此,HSVd的致病性是由多个碱基共同决定的,并且各个碱基所起作用大小是不同的。2.接种HSVd不同变体的黄瓜转录组分析。选取HSVd-g系列突变体中毒力最强的HSVd-g54和弱毒株系HSVd-h接种黄瓜。与HSVd-h相比,HSVd-g54能够诱导黄瓜植株较早发病,引起植株节间缩短、严重矮化,并且HSVd-g54在植株体内的积累量远远高于HSVd-h。通过RNA-seq分析了接种HSVd的黄瓜植株基因表达情况,并与对照植株进行了比较,找出差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),对 DEG 进行功能注释、GO term 及 KEGG 通路富集分析,结果显示,HSVd侵染激发了黄瓜的基本防御反应、抑制了光合作用、干扰了激素在植株体内的平衡、可能诱导了水杨酸(salicylicacid,SA)的积累和信号转导,同时还诱导了CsRDR 的上调表达,特别是 CsRDR1c1 和 CsRDR1c2。3.HSVd不同变体对黄瓜miRNA表达的影响。通过对接种弱毒株系HSVd-h、强毒株系HSVd-g54以及对照的黄瓜植株进行miRNA测序,共鉴定出65个已知miRNA和32个新miRNA。与对照植株相比,共有31个已知miRNA和21个新miRNA在接种HSVd的植株中发生显著性差异表达变化。对这些差异表达miRNA进行靶基因预测,结果显示,29个差异表达的已知miRNA对应着147个靶标基因。对这些差异表达的miRNA及其靶标基因进行分析,结果发现,cme-miR408的靶标基因LOC101220519编码碱性蓝蛋白(basicblueprotein),碱性蓝蛋白存在于叶绿体中,能与铜离子结合,在光合作用起到电子传递的作用。HSVd侵染能够诱导黄瓜中cme-miR408的上调表达,可能导致碱性蓝蛋白含量的降低。因此,HSVd可能通过cme-miR408来抑制黄瓜的光合作用。此外,还通过5’RLM-RACE确定了 cme-miR408在其靶标基因LOC101220519上的剪切位点,结果显示,cme-miR408的剪切位点主要位于其第10-11和11-12个碱基之间。