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目的:探讨CD70基因在肝癌中的表达,并对其在肝癌免疫逃逸中的作用进行初步探讨,为阐明肝癌的免疫逃逸机制奠定基础,为寻找肝癌免疫治疗的新靶点提供理论依据。研究方法:一.CD70在肝癌中的表达及其克隆表达1.RT-PCR检测CD70的在肝癌标本和肝癌细胞系中的表达设计合成针对CD70基因的特异性引物,收集肝癌组织、癌旁组织和肝癌细胞系BEL-7402、HepG2、SMMC-7721细胞,利用Trizol试剂抽提细胞总RNA,经RT-PCR检测CD70 mRNA的表达。2.真核表达载体PcDNA3-CD70的构建设计合成针对CD70基因编码区的PCR引物序列:上游引物包含HindⅢ酶切位点,下游引物包含BamHI酶切位点,以BEL-7402cDNA为模板,PCR扩增人CD70基因。PCR产物经HindⅢ、BamHI双酶切,回收后克隆入PcDNA3.0载体。连接产物转化大肠杆菌JM109,LA平板筛选阳性重组子,并经酶切、PCR、DNA测序分析鉴定。3.高表达真核表达载体PRK-CD70的构建设计合成针对CD70基因编码区的PCR引物序列:上游引物包含NotⅠ酶切位点,下游引物包含SalⅠ酶切位点,以BEL-7402cDNA为模板,PCR扩增人CD70基因。PCR产物经NotⅠ、SalⅠ双酶切,回收后克隆入PRK载体。连接产物转化大肠杆菌JM109,LA平板筛选阳性重组子,并经酶切、PCR、DNA测序分析鉴定。4.RT-PCR和Western blot方法检测CD70蛋白表达水平PcDNA3-CD70、PRK-CD70分别转染肝癌细胞系HepG2,24h后利用Trizol试剂抽提细胞总RNA,经PT-PCR检测CD70mRNA的表达,提取总蛋白,Western blot分析CD70蛋白表达情况。二.CD70蛋白在肝癌细胞系中对活化淋巴细胞的增殖抑制作用研究1.CCK8方法检测CD70对活化Jurkat增殖的影响将真核表达质粒pcDNA3-CD70、PRK-CD70转染肝癌细胞系HepG2（同时设空载体和空细胞对照）,转染24h后,与活化Jurkat共培养24h后,加入CCK8试剂,置37℃、5%CO2孵箱显色1.5h后,酶标仪上测450nm OD值,计算Jurkat增殖抑制率。2.RT-PCR检测Jurkat细胞活化前后CD27、Siva的表达情况设计合成针对CD27、Siva基因的特异性引物,分别收集活化前后Jurkat细胞总RNA,经RT-PCR检测CD27、Siva的表达情况。结果:一.CD70在肝癌中的表达及其克隆表达1.RT-PCR检测CD70的在肝癌标本和肝癌细胞系中的表达10例肝癌组织中3例CD70基因表达呈阳性,2例癌旁组织CD70基因表达均呈阴性。肝癌细胞系Bel-7402,SMMC-7721中CD70基因表达呈阳性,HepG2细胞中CD70基因表达呈阴性。2.成功构建真核表达载体PcDNA3-CD70阳性重组子质粒抽提后分别进行连接后单、双酶切、PCR、DNA测序分析鉴定,证明重组载体PcDNA3-CD70构建成功。3.高表达真核表达载体PRK-CD70的构建阳性重组子质粒抽提后分别进行连接后单、双酶切、PCR、DNA测序分析鉴定,证明重组载体PcDNA3-CD70构建成功。4.RT-PCR和Western blot方法检测CD70蛋白表达水平重组子（PcDNA3-CD70、PRK-CD70）DNA转染HepG2细胞后,RT-PCR和westernblot分别检测到CD70在RNA和蛋白质水平上有表达,并且高表达载体（PRK-CD70）的表达率较PcDNA3-CD70明显升高。二.CD70蛋白在肝癌细胞系中对活化淋巴细胞的增殖抑制作用研究1.肝癌细胞系中CD70可显著抑制活化Jurkat细胞的增殖CCK8结果显示,转染CD70后的HepG2与Jurkat共培养后,Jurkat增殖抑制率与空细胞对照组和空载体对照组相比显著升高。2.Jurkat细胞活化后CD27、Siva的mRNA表达水平明显升高RT-PCR结果显示,活化后Jurkat细胞CD27、Siva的mRNA水平较活化前明显升高。结论及意义:本研究首次采用PT-PCR检测了肝癌细胞系和肝癌标本中CD70的表达情况。结果显示肝癌细胞系BEL-7402,SMMC-7721中CD70表达呈阳性,HepG2细胞中CD70表达呈阴性。10例肝癌组织中3例CD70表达呈阳性,2例癌旁组织CD70表达均呈阴性。本研究首次构建了CD70真核表达载体（PcDNA3-CD70）,并构建了表达率较高的高表达真核表达载体（PRK-CD70）,并检测到其在RNA和蛋白水平均有表达。转染肝癌细胞系HepG2细胞,通过比较转染前后的肝癌细胞对活化的Jurkat细胞增殖的影响,发现转染CD70基因后的肝癌细胞明显抑制了Jurkat细胞的增殖。有研究指出CD70-CD27可引起活化淋巴细胞的凋亡。CD27和fas一样同属于肿瘤坏死因子受体超家族的成员,但CD27与fas受体不同,CD27的胞浆尾区缺乏胞浆死亡结构域。CD70转导凋亡信号需要借助一种凋亡前体蛋白,Siva。Siva蛋白含有一个类似胞浆死亡结构域的区域,与CD27的胞浆尾区结合传导凋亡信号。本研究采用PHA刺激Jurkat细胞使其活化,分别检测刺激前后Jurkat细胞CD27、Siva的mRNA表达,发现刺激后Jurkat细胞CD27、Siva的mRNA表达水平明显升高。由此可见,被CD70基因抑制的Jurkat细胞可能会有凋亡发生,但这还有待进一步证实。本研究首次提出了CD70在人肝癌中的免疫抑制作用,为进一步阐明肝癌的免疫逃逸机制奠定了基础,为寻找肝癌免疫治疗的新靶点提供理论依据。