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在高等植物的Cl代谢网络中,甲醇(CH3OH)的代谢是构成不依赖于叶酸的C1代谢的重要组成部分。外源性施用能够促进多种植物的生长,14C放射性示踪试验显示在植物体内CH3OH的代谢产生甲醛(HCHO)、甲酸(HCOOH)和C02。本研究通过遗传操作利用假丝酵母菌中的一个甲醇氧化酶(AOD1)在具有细菌HCHO同化途径(过量表达甲基营养细菌RuMP中固定HCHO的关键酶6-磷酸己酮糖合成酶(HPS)和6-磷酸果糖异构酶(PHI))的转基因烟草中构建一条甲醇光合同化途径,以提高其氧化甲醇和同化甲醇的能力。通过分析转基因烟草应答甲醇刺激生理生化特性的变化,研究高甲醇代谢作用与甲醇刺激植物生长的相关性,同时也为利用转基因植物同化Cl化合物构建一个研究平台。主要研究结果如下：AOD1是甲醇代谢中催化甲醇氧化分解的第一步(即氧化甲醇到甲醛并生成水)的关键酶。本研究构建AOD1基因的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-*T-AOD1在该载体中,AOD1的表达受光诱导型启动子(PrbcS)的控制,过量表达的AOD1通过叶绿体信号肽序列(*T)的作用定位到叶绿体基质。用pH2-35S-PrbcS-*T-AOD1和本实验室之前构建的HPS/PHI融合基因(rmpAB)的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-rmpAB转化烟草,在烟草叶绿体中同时过量表达AOD1蛋白和HPS/PHI融合蛋白,把甲醇氧化途径和RuMP途径整合成卡尔文循环的一个支路,在转基因烟草叶绿体中创造一个光合甲醇同化途径。在MS固体培养基条件下添加不同浓度的CH3OH,观察其对几种转基因烟草生长的影响,结果说明无论是在低浓度还是高浓度条件下同时过量表达AOD1和HPS/PHI的转基因烟草(AA)以及仅过表达HPS/PHI的转基因烟草(AB)生物量的增加都明显高于野生型烟草(WT)。而仅过表达AOD1的转基因烟草(A0)和WT在添加低浓度(2mM)甲醇的MS培养基上生长时生物量的增加高于没有甲醇刺激的对照植物,高浓度(6mM)甲醇对A0和WT烟草的生长没有刺激作用。用13CH3OH在MS固体培养条件下处理转基因烟草分析它们的甲醇代谢能力,同时分析甲醇处理转基因烟草叶片内氧化胁迫相关指标的变化,研究烟草的甲醇代谢作用与甲醇刺激其生长的相关性。结果表明在MS固体培养条件下添加2mM和6mM CH3OH均没有引起AA和AB转基因烟草叶片内氧化胁迫指标的升高,而在A0转基因烟草和WT烟草中6mM甲醇的处理却引起了叶片内多项氧化胁迫指标的升高,说明产生了较为严重的氧化胁迫。本实验室之前的研究发现野生型烟草中低浓度和高浓度13CH3OH代谢机制差异不大。13C-NMR分析结果说明WT烟草中13CH3OH代谢产生的H13CHO和H13COOH主要是流向C1代谢Cl-THF synthase/SHMT酶系统催化的反应,而不是卡尔文循环。然而在转基因烟草中导入RuMP甲醛同化途径使得H13CHO被更快速固定进入卡尔文循环,从和AB转基因烟草中H13CH0信号峰的强度无论是在低浓度还是高浓度甲醇处理条件下都低于WT烟草。H13CHO流入卡尔文循环后产生的主要代谢产物[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc的生成量也明显高于WT烟草,[U-13C]Gluc随后通过糖酵解途径流入三羧酸循环,再代谢生成N-转运氨基酸的碳骨架,其中[U-13C]Gln生成量的明显增加,说明13CH3OH氧化产生的13C代谢流在AA转基因植物中更多的是流入卡尔文循环。高浓度甲醇处理没有促进WT烟草的生长原因可能是,甲醇氧化积累的甲醛引起了叶片细胞的氧化损伤,从而抵消了甲醇对其生长的促进作用,6mM甲醇处理明显提高WT烟草叶片内多项氧化胁迫指标也证明了这一点。6mM甲醇刺激仍可以促进AA转基因烟草生长的原因,可能是因为甲醇氧化产生的甲醛通过转基因烟草中安装的甲醛固定途径快速同化整合进入卡尔文循环而迅速脱毒,因此没有引起烟草叶片的氧化损伤。这些研究结果说明甲醇同化作用是对甲醇氧化作用产生的甲醛进行脱毒,与甲醇刺激烟草的生长无关。在高浓度甲醇刺激时,如果植物自身甲醛脱毒能力有限时,甲醛的毒害作用会抵消甲醇刺激植物生长的效果。