大曲具有糖化、发酵、酒化和生香等功能,不但为大曲酒的发酵、成香提供必不可少的微生物菌群和风味前驱物,还提供发酵所必须的丰富的生物催化剂——酶类。大曲,作为大曲酒品质和产量的重要保障,一直是白酒行业研究的重点。单宁酶(EC3.1.1.20),也称作单宁酰基水解酶、鞣酸酶。单宁酶能水解没食子单宁中的酯键和缩酚羧键,生成葡萄糖和没食子酸,同时影响着白酒的风味及品质,单宁酶在食品、化工和制药等领域有着广泛的应用。酯化酶是浓香型白酒生产中的最为的重要酶类之一,酶化酶含量多少和酶活高低,都与白酒优质酒率有着密不可分的关系。蛋白酶在白酒酿造过程,不仅能水解发酵原料和菌体的蛋白质,还能促进产酒和生香、降低杂醇油含量。脂肪酶为微生物生长繁殖,以及白酒风味物质具有一定影响。实验以单宁酶、蛋白酶、酯化酶、脂肪酶为研究重点,采取平板分离法筛选产酶微生物,通过测算透明圈直径与菌落直径比值判断各菌落产酶能力并对菌落形态进行分辨描述,利用分子生物学手段对纯化菌株进行5.8S PCR和16S PCR分子鉴定。各酶产生菌菌落形态及种属情况如下所示。(1)实验分离得到产单宁酶的真原核微生物菌落共有16个类别,其中真核产生菌有9个类别,比原核产生菌多了两类,且发酵期大曲样品中的真核单宁酶产生菌菌落形态多样性显著多于成熟期的大曲样品。分子生物学鉴定得到产单宁酶真核微生物有三个属(Penicillium、Aspergillus和Byssochlamys),其中Aspergillus有六个种,占全部单宁酶真核产生菌的60%。其次是Penicillium属的Penicillium commune strain、Penicillium chrysogenum strain和Penicillium robsamsonii三个种。鉴定到的单宁酶原核产生菌的三个属都各只一个种,即Bacillus siamensis strain、Oxalophagus oxalicus strain和Pedobacter sp。其中,Byssochlamys spectabilis strain和Bacillus siamensis strain在发酵期样品中出现频次较高。而成熟期样品出现频次较高的种为Aspergillus和Pedobacter属微生物。此外,真核单宁酶产生菌Penicillium robsamsonii和原核微生物Oxalophagus oxalicus strain产单宁酶的研究,还未见报道。(2)酯化酶真核产生菌的菌落形态有11类主要为白色菌落,22类原核微生物菌落形态中圆形、白色或略带黄色的扁平菌落形态居多。在所有大曲样品中,有五类真核和十三类原核微生物菌落形态在两个阶段的大曲样品中都有出现,表现出大曲发酵和成熟阶段中不同类别微生物的动态变化的多样性情况。鉴定到的酯化酶原核产生菌有3个属(Bacillus、Paenibacillus和Cronobacter)14个种,其中Bacillus属的11个种表现出最为丰富多样性信息,且是产酯化酶原核微生物中在两个阶段大曲样品中都占绝对优势的菌群。而真核酯化酶产生菌的6个属中,只有11个种,各有三个种的Aspergillus和Lichtheimia属分别为发酵期和成熟期样品中的主要的真核酯化酶产生属微生物。其中Lichtheimia ornate、Bacillus wiedmannii strain和Paenibacillus relictisesami strain鲜见产酯化酶的相关报道。(3)蛋白酶产生菌中,真核微生物菌落形态有10类,原核有23类。与蛋白酶产生菌菌落形态情况相比,脂肪酶产生菌中真核产生菌菌落形态类别数一样,而原核的类别数减少了78%。结合种属鉴定结果可知,蛋白酶真核微生物产生菌中鉴定得到的5个属Lichtheimia、Mycocladus、Penicillium、Fungal和Aspergillus中的Aspergillus和Penicillium也有产生脂肪酶的种存在。两种酶的原核产生菌共有三个属(Bacillus、Hafnia和Bacillus)中,只有Bacillus的三个种(Bacillus licheniformis、Bacillus sonorensis strain和Bacillus paralicheniformis)具有分泌产生脂肪酶的能力。在所有此两类酶鉴定得到的微生物中,Lichtheimia ornata产蛋白酶和Aspergillus oerlinghausenensis产脂肪酶为本研究首次报道。大曲中微生物群落组成、功能微生物考察、某种微生物产酶谱等方面都有大量研究。然而,追踪大曲发酵和成熟的整个过程,并针对其主要酶类产生菌进行微生物多样性分析方面的研究,还不多见。因此,为了考察大曲制作与成熟过程中主要功能酶类产生菌的种属多样性信息、动态演变过程、交替更迭关系。实验以整个大曲发酵和成熟过程中的样品为基础,采用可培养方式分离、筛选和鉴定主要酶类产生菌,分析真核与原核产酶微生物菌落形态差异、种属分布情况及动态变化关系,以期为功能酶制剂的开发、强化曲的研究、大曲微生物及酶系作用的机理性探索打下坚实基础。