临床上多种原因可导致肺泡内液体集聚过多,如:支气管肺泡灌洗、淹溺、心功能不全、急性肺损伤等。目前已研究证实肺泡内液体清除过程主要是由肺泡上皮细胞主动重吸收钠,再由基底侧细胞膜上钠钾ATP酶将其泵入到肺间质,肺泡内的水在渗透压梯度作用下通过上皮细胞膜的水通道或单纯扩散进入肺间质,最后由淋巴管或毛细血管回吸收。肺泡液体清除率(alveolar Fluid clearance,AFC)与肺水肿之间关系密切,提高肺泡液体的清除率,可以加速肺泡内积聚的液体的清除,促进肺水肿液的回吸收,在此过程中,肺泡上皮细胞顶膜上的钠通道及基底膜上的钠钾ATP酶的功能状态决定了肺泡上皮细胞的液体转运能力。钠钾ATP酶是广泛存在于膜上的异二聚体跨膜离子转运蛋白,在肺泡液体清除过程中,钠钾ATP酶的功能是形成细胞膜内外渗透性梯度差,引起钠离子顺浓度差转运,使3个钠离子被转运出细胞的同时泵入2个钾离子。钠钾ATP酶在肺泡上皮细胞膜上表达增加或其活性增强能够促进肺泡液体清除。相反,钠钾ATP酶在肺泡上皮细胞膜上低表达或抑制其活性则导致肺泡液体清除率下降。因此钠钾ATP酶的功能是调节肺泡上皮功能的一个重要的和基础的分子机制。胆碱能神经在肺组织内广泛分布,调节着气道张力、血流供应、黏液分泌以及呼吸型式等,胆碱能M型和N型受体在人和鼠类肺泡上皮细胞上分布,自2000年以来多项研究采用迷走神经切断或电刺激迷走神经方法研究胆碱能神经在脓毒症或非脓毒症(机械通气、缺血再灌注、油酸诱导等)急性肺损伤中的抗炎或抗凋亡作用。最近膜片嵌技术研究发现胆碱能受体激动剂卡巴胆碱和oxotremorine能够剂量依赖性地激活大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞钠电流,提示胆碱能受体参与调解了肺泡上皮的钠离子转运。临床上在进行支气管肺泡灌洗操作时,如果应用M胆碱能受体阻断剂阿托品能够增加肺泡液体回吸收量。推测胆碱能神经可能参与调节肺泡液体转运,但目前对于胆碱能神经在肺泡液体清除中的作用尚未见国内外报道,因此本研究采用了迷走神经切断、电刺激的方法以及外源性给予氯化乙酰胆碱研究了乙酰胆碱在肺泡液体转运中的作用,并进一步探讨了氯化乙酰胆碱与肺泡上皮钠钾ATP酶的相互作用,具体内容如下:第一部分迷走神经干预对小鼠肺泡液体清除作用的影响目的:采用迷走神经切断或电刺激的方法观察迷走神经在肺泡液体转运中的作用,进而证明内源性乙酰胆碱参与调解了肺泡液体转运。方法:60只清洁雄性Balb/c小鼠,体重28-30g,随机分为4组,每组15只,其中每组中6只用来测量肺泡液体清除率(AFC),6只用来测定血浆中乙酰胆碱的水平,3只用来行HE染色。①假手术对照组(Con):左侧迷走神经分离,但不处理干预。②左侧迷走神经切断(LVAG):左侧迷走神经分离切断。③左侧迷走神经外周端刺激(LVS1):左侧迷走神经分离切断,电极刺激其外周端,即传出神经。④左侧迷走神经中枢端刺激(LVS2):左侧迷走神经分离切断,电极刺激其中枢端,即传入神经。将含有Evans蓝标记的5%白蛋白等渗生理盐水溶液250ul以每2分钟一次,每次50ul的速度注入小鼠的肺泡腔内,实验20分钟后颈动脉放血处死小鼠回吸收肺泡内剩余液体,用酶标仪测量Evans蓝标记的白蛋白浓度,根据注入前后白蛋白浓度的变化计算肺泡液体清除率,以观察迷走神经在肺泡液体转运中的作用。因乙酰胆碱在血浆内快速被代谢,我们收集迷走神经干预即刻的血浆标本,用南京建成的试剂盒测量血浆乙酰胆碱的含量,从而间接反映迷走神经干预影响了血浆乙酰胆碱水平。HE染色标本收集了灌注后30分钟的组织标本,从形态学上观察迷走神经干预对肺泡液体清除过程的影响。结果:与正常对照组相比,左侧迷走神经切断明显降低了AFC(66.88±2.64%VS 48.69±2.57%;P<0.01);与左侧迷走神经切断组相比,左侧迷走神经外周端刺激明显升高了AFC(48.69±2.57%VS60.81±1.96%;P<0.01);而左侧迷走神经中枢端刺激出现了更为降低的AFC(38.49±1.45%VS 48.69±2.57%;P<0.05)。与对照组血浆中的乙酰胆碱水平(4.64±0.25ug/ml)相比,左侧迷走神经切断(3.59±0.27ug/ml)及左侧迷走神经中枢端刺激(2.98±0.18 ug/ml)血浆中的乙酰胆碱水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),而在迷走神经外周端刺激组(6.01±0.54 ug/ml)明显升高,且差异具有明显统计学意义(P<0.01)。HE染色结果显示对照组有轻度间质水肿;单侧迷走切断组肺泡腔内可见较多粉红色灌注液,间质水肿明显;外周端刺激组相对于单侧迷走切断组间质水肿减轻。结论：1单侧迷走神经切断降低了AFC,提示迷走神经参与调节了肺泡液体转运。2电刺激迷走传出神经而非传入神经能够逆转降低的AFC,提示迷走神经促进肺泡液体转运是通过其传出神经发挥作用。3电刺激迷走神经外周端明显升高了血浆乙酰胆碱的水平,提示电刺激迷走神经传出段促进肺泡液体清除可能是通过其末梢释放内源性乙酰胆碱发挥作用。第二部分氯化乙酰胆碱对肺泡液体清除率及肺组织钠钾ATP酶的影响目的:观察外源性氯化乙酰胆碱对肺泡液体清除率及其肺组织匀浆钠钾ATP酶的影响方法:昆明小鼠75只,随机分为5组,每组15只,其中每组中6只用来测量肺泡液体清除率(AFC),6只用来留取标本测量钠钾ATP酶活性及蛋白表达,其余3只留HE染色组织标本。①正常对照(control)。②10-4mol/L乙酰胆碱。③10-5mol/L乙酰胆碱。④10-6mol/L乙酰胆碱。⑤10-6mol/L乙酰胆碱+10-6mol/L阿托品。肺泡腔灌注液为Evans蓝标记的5%白蛋白等渗生理盐水内加入上述各组不同浓度的药物,将灌注液200ul以每次40ul,每2分钟一次的速度注入昆明小鼠的肺泡内,20分钟后用100ul的微量进样器回吸收肺泡内残余液体,用酶标仪测定Evans蓝标记的白蛋白浓度,根据注入前后白蛋白浓度的变化计算肺泡液体清除率。肺组织灌注液调整为生理盐水稀释的不同浓度的氯化乙酰胆碱,收集肺组织标本以用来测定钠钾ATP酶的活性(南京建成的试剂盒)、膜上Na,K-ATPɑ1蛋白(western blot)表达及HE染色。结果:1与对照组相比,氯化乙酰胆碱剂量依赖性增加了AFC,10-4M氯化乙酰胆碱上调肺泡液体清除率达到较高值(42.95±2.41%vs 57.93±3.21%P≤0.01)。10-6M阿托品阻断了10-6M氯化乙酰胆碱上调AFC的作用(45.17±1.05%vs 48.99±1.42%P≤0.05)。2对照组Na,K-ATP酶的活性是3.69±0.19u/mgprot,在氯化乙酰胆碱刺激组其活性分别是10-4M Ach5.85±0.21 u/mgprot;10-5M Ach 5.14±0.22 u/mgprot;10-6M Ach 4.4±0.14 u/mgprot,10-4-10-6M氯化乙酰胆碱明显增加了Na,K-ATP酶的活性(P<0.05),10-6M阿托品阻断了10-6M氯化乙酰胆碱对Na,K-ATP酶的作用(3.12±0.42 u/mgprot vs 4.4±0.14 u/mgprot P<0.05)。3与正常对照组相比,乙酰胆碱刺激各组肺组织匀浆Na,K-ATPɑ1蛋白的表达没有明显差别(P>0.05)。结论：1胆碱能神经激动剂氯化乙酰胆碱能够剂量依赖性增加肺泡液体清除率,阿托品能够阻断该效应。2氯化乙酰胆碱能够增加肺组织匀浆Na,K-ATP酶的活性,阿托品同样能够阻断该效应。3氯化乙酰胆碱刺激对肺组织匀浆上总Na,K-ATPɑ1的蛋白表达没有影响。第三部分氯化乙酰胆碱对A549细胞上Na,K-ATP酶的影响目的:培养肺泡上皮A549细胞,观察10-5M氯化乙酰胆碱刺激对该细胞膜上Na,K-ATP酶的活性及蛋白表达量的影响。方法:A549接种至培养皿后,随机分为正常对照组(Con),氯化乙酰胆碱刺激组(10-5mol/L),氯化乙酰胆碱加阿托品阻断组(10-5mol/L Ach+10-5mol/L Atr),分别观察5分钟、10分钟,并用酶活性测定试剂盒测量细胞上Na,K-ATP酶的活性,采用免疫荧光及western-blot方法观察细胞膜上Na,K-ATP酶蛋白的表达。结果:1与对照组相比,10-5M氯化乙酰胆碱刺激明显增加了Na,KATPase的活性,5分钟时(3.27±0.23 u/mgprot VS 5.34±0.5 u/mgprot P<0.01),10分钟时(3.22±0.11 u/mgprot VS 3.91±0.22 u/mgprot P<0.05)。与氯化乙酰胆碱刺激组相比,加入阿托品阻断胆碱能M受体后,Na,K-ATPase的活性显著下降,5分钟(5.34±0.5 u/mgprot VS 3.62±0.29 u/mgprot P<0.01),10分钟(3.91±0.22 u/mgprot VS 3.27±0.16u/mgprot P<0.05)。2免疫荧光结果显示:与对照组相比,10-5M氯化乙酰胆碱刺激5分钟细胞膜上Na,K-ATPase蛋白的绿色荧光未见明显差别,细胞连接基底侧细胞膜上可见明显的荧光积聚,提示用药组基底侧细胞膜上出现Na,K-ATPase蛋白积聚。3 western-blot结果显示:以对照组灰度值相比,氯化乙酰胆碱刺激5分钟明显增加了基底侧细胞膜上相对的Na,K-ATPaseɑ1蛋白含量,与刺激组灰度值相比,胆碱能M受体阻断剂阿托品阻断了氯化乙酰胆碱的作用。结论：1氯化乙酰胆碱能够增加A549细胞钠钾ATP酶在基底侧细胞膜上的表达,同时增强其在膜上的活性。2氯化乙酰胆碱刺激钠钾ATP酶在基底侧细胞膜上的表达增加及活性增强可被M型胆碱能受体阻断剂阿托品阻断,提示氯化乙酰胆碱调节肺泡上皮细胞膜上钠钾ATP酶的功能可能是通过M受体发挥作用。