论文部分内容阅读
目的:基于Wnt-β-catenin信号通路，探讨柔肝中药提取物HBP-A防治骨关节炎(Osteoarthritis，OA)的作用机理。
方法:1）在体实验:采用6周龄的雄性SD（SpragueDawley，SD）大鼠，按体重随机分成空白组、模型组、西药组和中药组，每组15只。采用改进ACLT(anteriorcruciateligamenttransection)造模方法建立膝骨关节炎模型，同时各组连续灌胃6周（空白与模型组采用蒸馏水，西药组与中药组分别采用硫酸氨基葡萄糖156.25mg/kg/天或HBP-A31.25mg/kg/天灌胃）。此后，全部大鼠抽取腹主动脉血，用其血清进行后续体外实验一，并分离双侧膝关节。各组膝关节分别进行Micro-CT扫描、苏木精—伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色和番红固体绿（SafraninO，SO）染色、用专业图像分析软件(IPP5.0)测量软骨和软骨下骨的厚度，抽提相应部位RNA，以聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)测各组软骨与软骨下骨内β-catenin、金属基质蛋白酶(Matrixmetallopeptidase，MMP-13)、Sox-9（SexdeterminingRegionY-box9，Sox-9）基因表达情况。
2)体外实验一:用Ⅱ型胶原酶消化法提取24h龄的SD大鼠膝关节和肘关节等透明软骨细胞培养，采用阿利新蓝、甲苯胺蓝染色，Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定细胞，增殖细胞核抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen，PCNA)免疫荧光染色检测细胞活性。取第二代软骨细胞，用在体实验采集的各组含药血清分2.5％、5％、10％浓度培养。抽提各组细胞的RNA，利用Real-timePCR检测β-catenin和MMP-13基因表达情况。
3)体外实验二:培养软骨细胞，取第二代软骨细胞在培养基中添加10ng/ml白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)因子，诱导软骨细胞分化，分为空白组，IL-1β组，IL-1β+IWP-2（Wnt通路抑制剂）组，IL-1β+HBP-A组，IL-1β+IWP-2+HBP-A组共5组培养，并在24h，48h和72h不同时间点分别提取相应组别的RNA和蛋白，利用Real-timePCR和Western-blot检测β-catenin、MMP-13、Sox-9等基因及蛋白表达。
以上所有数据用SPSS16.0统计软件包处理。
结果:ACLT造模6周后的大鼠软骨出现OA样改变，病理积分与软骨缺损程度增加，但软骨与软骨下骨也出现厚度增加的现象，中药HBP-A干预后，可以改善软骨病理积分（中药组9.8±1.89VS模型组12±1.06，P＜0.05），降低软骨缺损程度（中药组4.7±0.57VS模型组3.9±0.418）;在软骨组织中，模型组β-catenin、MMP-13表达水平升高，中药治疗组出现相应的下调;在软骨下骨组织中，HBP-A对以上通路的调控作用不明显。
体外单纯用Ⅱ型胶原酶消化法可获得纯度高，增殖能力旺盛的软骨细胞。采用中药含药血清培养软骨细胞后，β-catenin、MMP-13基因表达有所下降。
添加IL-1β因子诱导的软骨细胞出现Wnt-β-catenin通路活化现象，添加中药和wnt抑制剂，在基因与蛋白层面，均可使Wnt3a、β-catenin、MMP-13表达下降，Sox-9表达升高，从而抑制Wnt-β-catenin通路高表达，并且HBP-A与wnt抑制剂IWP-2呈现协同作用。
结论:中药可以改善骨关节炎模型动物的病理形态，在对wnt通路的作用更多表现在软骨层面;其血清代谢物与提取物本身均能影响Wnt信号通路上的Wnt-3a，β-catenin，MMP-13，Sox-9的表达，并且可与Wnt抑制剂起协同调节作用。