猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病,被世界动物卫生组织列为必须上报的动物传染病之一。近年来,国内外对猪瘟的研究多数集中在诊断方法和新型疫苗的研发方面,而对猪瘟病毒致病机理研究较少。在CSFV编码的非结构蛋白中,NS2的蛋白功能尚不清楚。本文以揭示CSFV NS2蛋白的功能为目标,开展了NS2蛋白的降解特性、亚细胞定位特点、NS2蛋白对宿主细胞周期与增殖的影响及NS2蛋白对宿主细胞炎症因子的表达调控等方面的研究,取得了如下研究结果:(1)采用RT-PCR方法成功扩增到了CSFV NS2基因。生物信息学分析表明,CSFV NS2基因全长为1371bp,共编码457个氨基酸,编码蛋白质的分子质量约为53 ku;CSFV NS2蛋白的N-端极有可能具有5个跨膜区,N-端具有极强的疏水性,而C-端则表现出良好的亲水性;CSFV NS2蛋白N-端第1-170位氨基酸形成的结构多以β-折叠为主,而C-末端则以α-螺旋为主;磷酸化分析表明,NS2蛋白第223位和第224位的丝氨酸的磷酸化可能性很高;第37位和第47位的苏氨酸、第204位、第332位和第392位的酪氨酸也有很强的磷酸化特性。(2) CSFV NS2基因与绿色荧光蛋白报告基因进行融合表达,Western blot分析发现CSFV NS2蛋白的分子质量约为53 ku,该蛋白通过蛋白酶体途径快速降解,这一降解过程可以被特异性的蛋白酶体抑制剂MG132所抑制。共定位研究表明,CSFV NS2蛋白定位于细胞的内质网上,而且至少含有2个内部信号肽序列、4个跨膜区。(3)细胞增殖能力试验表明,CSFV NS2蛋白对宿主细胞的增殖活性具有一定的抑制作用。流式细胞术分析发现,CSFV NS2蛋白的表达诱导宿主细胞周期阻滞于S期,但并不是通过诱导细胞的凋亡来抑制细胞的增殖。mRNA水平和蛋白水平分析表明,CSFV NS2蛋白能够促进Cyclin A蛋白被蛋白酶体快速降解,但是并不影响该基因的转录。(4) CSFV NS2蛋白能够引起宿主细胞内质网应激反应,激活核转录因子NF-кB,CSFVNS2蛋白及Cyclin A蛋白被蛋白酶体所快速降解可能与内质网应激反应有关。(5)采用间接免疫荧光、RT-PCR等方法检测CSFV在血管内皮细胞中的敏感性及增殖状况。结果表明,CSFV E2蛋白主要分布在细胞质中,CSFV在血管内皮细胞中的增殖良好,而且CSFV的感染能够显著上调血管内皮细胞表明黏附分子整合素β3表达的表达,深入的研究发现,CSFV NS2蛋白在其中起着重要的作用。(6) CSFV NS2蛋白的表达通过激活NF-кB来诱导血管内皮细胞中IL-8的表达上调,MG132却能够通过抑制NF-кB的活性来抑制IL-8的表达,而CSFV NS2蛋白的表达能够对抗MG132对NF-кB的活性和IL-8表达的影响;(7)蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导正常细胞的凋亡,但是,表达CSFV NS2蛋白的细胞表现出对MG132诱导凋亡作用的抗性,深入的研究表明,CSFV NS2蛋白能够上调宿主细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。综上所述,本研究对CSFV NS2蛋白的特性及其与宿主细胞之间的相互作用进行了一系列的研究。首次发现了其降解特性与亚细胞定位特征,通过体外试验揭示了该蛋白对细胞周期与细胞增殖的调控机制,明确了CSFV NS2蛋白的表达对血管内皮细胞表面黏附分子整合素β3、趋化因子IL-8、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达的调节作用与机制。本项研究所取得试验结果为CSFV NS2蛋白的功能增添了新的内容,为更加深入了解CSFV致病的分子机制提供了一些新的理论资料。