PSMB5对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

来源 :山西医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:w332365605
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目的:探讨20S蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)对体外扩增培养人骨髓间充质干细胞(humanbone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)增殖能力的影响,明确调控hBMSCs细胞活力的有效靶点,从而为干细胞临床移植奠定实验基础。方法:体外分离培养hBMSCs,依据体外传代次数将其分为早期组(1-3代)和晚期组(12-14代)。1.检测PSMB5在早期和晚期hBMSCs的表达变化。(1)通过溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入实验和流式细胞术检测早期和晚期hBMSCs增殖能力。(2)应用荧光酶标仪检测早期和晚期hBMSCs20S蛋白酶体活性。(3)应用real-time PCR技术分析蛋白酶体β亚单位PSMB1、 PSMB5和PSMB6的表达变化;应用Western blotting检测早期和晚期20S蛋白酶体和PSMB5亚单位的表达变化。2.构建携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的PSMB5-shRNA慢病毒载体,并设错义序列对照,感染早期hBMSCs,观察PSMB5基因沉默对hBMSCs增殖能力的影响。(1)慢病毒感染细胞后倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,判断感染效率。(2)应用real-time PCR和Western blotting分别从基因和蛋白水平检测PSMB5抑制效率。(3)荧光酶标仪检测20S蛋白酶体活性的变化。(4)应用Ki67和BrdU免疫荧光染色检测hBMSCs增殖率,Western blotting检测细胞周期相关蛋白(Cyclin D1)的表达变化。结果:1.(1)BrdU掺入实验结果证明早期hBMSCs BrdU阳性率为68.92±7.08%,晚期hBMSCs阳性率为27.67±2.76%,提示传代晚期hBMSCs增殖能力较早期细胞显著降低(P<0.01);流式细胞仪分析结果显示,晚期hBMSCs S期细胞(4.42±0.98%)较早期hBMSCs(13.72±1.58%)显著减少(P<0.01),细胞增殖指数较早期细胞降低11.02±1.88%(P<0.05),进一步说明扩增培养晚期hBMSCs增殖活力降低。(2)晚期hBMSCs20S蛋白酶体活性较早期显著降低52.99±13.08%(P<0.01),提示20S蛋白酶体活性可能与hBMSCs细胞活力有关。(3)real-time PCR结果表明,传代晚期细胞蛋白酶体亚基PSMB1、PSMB5表达水平较早期分别降低13.0±1.0%和37.0±8.0%(P<0.01),且PSMB5下降最为明显;同时,Western blotting实验进一步表明晚期hBMSCs20S蛋白酶体和PSMB5表达水平分别比早期下降54.51±5.94%(P<0.05)和52.99±13.08%(P<0.05),提示20S蛋白酶体核心亚单位PSMB5可能是调控hBMSCs细胞活力的关键因素。2.(1)PSMB5-shRNA慢病毒感染早期hBMSCs,24h后隐约可见部分细胞发出绿色荧光,但是信号较弱;72h后荧光信号增强,约90%以上细胞可见绿色荧光。(2)real-time PCR和Western blotting结果证实,PSMB5-shRNA组PSMB5mRNA和蛋白的表达水平分别较GFP对照组下调93.3±0.34%(P<0.01)和56.9±13.31%(P<0.05),提示慢病毒介导的shRNA能够有效下调目的基因PSMB5的表达水平。(3)PSMB5-shRNA组20S蛋白酶体活性较GFP对照组降低69.87±1.32%(P<0.05),提示下调PSMB5表达水平能够降低早期hBMSCs20S蛋白酶体活性。(4)Ki67免疫荧光染色结果显示,PSMB5-shRNA组Ki67阳性率较GFP对照组降低76.18±12.37%(P<0.01);同时BrdU掺入实验结果也证明,PSMB5-shRNA组BrdU阳性率26.14±8.13%较GFP对照组49.53±11.18%显著降低(P<0.01),表明PSMB5基因沉默能够抑制早期hBMSCs增殖能力。此外,Western blotting实验结果证明PSMB5-shRNA组细胞周期相关蛋白Cyclin D1表达水平较GFP对照组降低54.55±5.49%(P<0.05),提示PSMB5基因下调可能通过抑制细胞周期进程,从而影响hBMSCs增殖能力。结论:(1)晚期hBMSCs增殖能力降低,并且20S蛋白酶体活性及其核心亚单位PSMB5表达水平下降。(2)应用基因沉默技术手段下调PSMB5表达水平,能够抑制早期hBMSCs增殖能力,提示PSMB5可能是影响hBMSCs增殖活力的关键靶点。
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