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肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic E.coli, EHEC)O157:H7是一种非侵入性的革兰氏阴性致病菌,可引起腹泻、出血性结肠炎、尿毒综合征等一系列并发症,对人体有强烈的致病性与致死性,严重危害人类的生命健康。O157:H7对小肠上皮细胞的黏附能力是疾病发展的关键,细菌可通过Ⅲ型分泌系统(T3SS)黏附在宿主细胞表面并向细胞内注入了各种毒力效应分子,这些毒力效应分子共同破坏宿主细胞正常的生理机制,如聚集肌动蛋白形成基座结构,破坏细胞之间的紧密连接,最终在小肠上皮细胞表面发生黏附/擦拭损伤(A/E损伤),从而使致病菌逃避细胞的免疫反应。毒力相关的T3SS是一种结构和功能高度保守的,呈“针”样结构的蛋白质运输装置,大约由20多个保守蛋白构成。由escR基因编码的EscR蛋白是T3SS的结构蛋白之一,该保守蛋白的缺失会导致T3SS功能发生缺陷,从而影响致病菌对细胞的黏附作用。鼠类柠檬酸杆菌感染小鼠可导致小鼠的A/E损伤,相较于0157：H7对人体强烈的致病性,该菌不能感染人体,可作为研究0157：H7的模式菌。NleB是A/E损伤致病菌中存在的保守蛋白,蛋白质分子量约为38kDa。鼠类柠檬酸杆菌中的效应分子NleB是一种糖基转移酶,其酶活性与NleB中"DXD"结构密切相关,并可特异性抑制TNF介导的NF-κB信号通路的激活。O157:H7EDL933菌株中有两套nleB基因,即z4328和zO985,分别编码假想蛋白NleB1(Z4328)和NleB2(Z0985。我们通过序列比对分析发现,EDL933菌株中的基因z4348和zO985,分别和鼠类柠檬酸杆菌的nleB基因有89%和62%的一致性。通过对氨基酸序列分析,我们发现EDL933的假想蛋白NleB1和NleB2中均具有‘’DXD"结构。我们大胆推测假想蛋白NleB1、NleB2具有与NleB类似的生化作用机制,并围绕相关内容进行课题的研究。本研究中构建了pGEX-2TK-NleB2原核表达载体,IPTG成功诱导GST-NleB2融合蛋白的表达,该蛋白主要以可溶性形式进行表达,我们对其可溶性表达条件进行摸索和优化,谷胱甘肽琼脂糖凝珠纯化该蛋白后多次免疫小鼠,成功制备了小鼠抗GST-NleB2融合蛋白的多克隆抗体,并成功检测到了N1eB2蛋白在0157：H7野生株中的天然表达。本研究结合重叠延伸PCR技术以及经典的λRed同源重组技术,融合了含卡那霉素抗性基因kan以及escR基因上游和下游基因的同源打靶DNA片段,采用一步敲除法,电击转入含pKD46质粒的EDL933感受态细胞中,以抗性基因kan置换0157:H7EDL933菌株的escR基因,经过抗性筛选、PCR以及测序鉴定分析,成功构建了使EscR蛋白的功能失活的T3SS缺陷突变株△escR。绘制了0157：H7野生型菌株和T3SS缺陷突变株△escR在LB和DMEM (10%FBS)培养基中培养的生长曲线,观察二者的生长速度变化。用DMEM (10%FBS)培养过夜的野生型菌株与△escR分别感染HeLa细胞,洗去未黏附的细菌后,通过免疫荧光分析二者对HeLa细胞的黏附能力。结果反应,与野生株相比,缺陷突变株△escR对HeLa细胞的黏附能力显著下降。该结果提示T3SS对0157：H7致病性的重要性。本实验构建的T3SS缺陷株△escR,是用于鉴定NleB1和N1eB2是否为可通过T3SS系统分泌且注入细胞的效应蛋白。我们以EDL933菌株基因组为模板,对基因z4348和z0985进行了克隆,分别连接到原核胞质表达载体pFLAG-MAC上,并将获得的这两种重组质粒分别转化到野生型0157：H7和T3SS缺陷突变株△escR中,通过Western blot印迹分析得知,IPTG可成功诱导Flag-NleB1、 Flag-NleB2重组蛋白在这两种菌株中表达。用DMEM (10%FBS)培养基分别培养以上四种菌株,收集菌液以及过滤除菌的培养基上清,浓缩蛋白后进行Western blot印迹分析,我们发现,野生型O157:H7培养基上清中检测到Flag-NleB1和Flag-NleB2蛋白,△escR菌株培养基上清中均未检测到这两种重组蛋白,说明缺失了T3SS的△escR菌株不能分泌Flag-NleB1和Flag-NleB2蛋白。随后,用以上四种菌株分别感染HeLa细胞,洗去未黏附的细菌,用Flag标签抗体进行免疫荧光定位分析,结果发现,T3SS缺陷株△escR感染的HeLa细胞并未检测到Flag-NleB1和Flag-NleB2蛋白,但可在含重组质粒的野生型O157:H7感染的HeLa细胞检测到,说明Flag-NleB1和Flag-NleB2蛋白需要借助T3SS分泌到HeLa细胞。本课题中,我们成功用抗GST-N1B2多克隆抗体检测到了野生型O157:H7的蛋白N1eB2的天然表达。同时,证明了NleB1和NleB2实际上是可通过T3SS分泌至宿主细胞的的效应分子。我们也发现了T3SS缺陷突变株A escR对HeLa细胞的黏附能力有所减弱。本研究同时也为效应分子NleB1和NleB2的分子机制研究做出实验准备,为后续研究效应分子NleB1和NleB2具体的生化机制及其与宿主细胞相互作用奠定了基础,从而进一步研究和阐明O157:H7的致病机制。